正丙醇/碳酸鈉雙水相體系提取發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的研究

張智維， 劉　婷， 韓　飛

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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正丙醇/碳酸鈉雙水相體系提取發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的研究

張智維， 劉婷， 韓飛

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：為彌補(bǔ)傳統(tǒng)提取方式成本高、連續(xù)性差等缺點(diǎn)，采用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系，從發(fā)酵液中分離提取了γ-PGA，且γ-PGA富集在鹽相.采用正交試驗(yàn)研究了正丙醇濃度、碳酸鈉濃度、溫度、pH等對(duì)γ-PGA提取率的影響.結(jié)果表明，選用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系的最佳提取條件為：正丙醇濃度18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉濃度14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度40 ℃、pH 10.在此條件下，γ-PGA的提取率為98.07%，說(shuō)明該方法可行.

關(guān)鍵詞：雙水相體系； 提??； γ-聚谷氨酸； 正交試驗(yàn)

0引言

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D型和L型谷氨酸單體通過(guò)α-氨基和γ-羧基組成的同源聚酰胺[1].γ-PGA具有水溶性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、無(wú)毒等特點(diǎn)，故在工業(yè)應(yīng)用中顯示出了很大潛力[2].例如，在食品工業(yè)中可作為增稠劑和穩(wěn)定劑，在廢水處理中可作為生物絮凝劑，在醫(yī)藥中可作為藥物載體和控釋材料，在農(nóng)業(yè)中可作為肥料，在化妝品中可作為保濕劑[3]等.

微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)γ-PGA優(yōu)先選擇的方法[4,5].目前，提取γ-PGA的方法主要有：有機(jī)溶劑沉淀法、化學(xué)沉淀法和膜分離法[6,7]等.有機(jī)溶劑沉淀法是最常用的方法，但有機(jī)溶劑的用量太大，提取成本較高，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[8,9]；化學(xué)沉淀法的后續(xù)脫鹽步驟比較復(fù)雜[10]；膜分離法容易堵塞、連續(xù)化程度低[11].

雙水相萃取具有處理量大、萃取效率高、易于連續(xù)操作、易于工藝放大[12]等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)γ-PGA提取方式的缺點(diǎn).目前，雙水相萃取技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于提取蛋白質(zhì)[13]、氨基酸[14]、酶[15]、抗生素[16]等領(lǐng)域.

本文采用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系提取發(fā)酵液中的γ-PGA，主要是利用γ-PGA在兩相中的選擇性分配，實(shí)現(xiàn)與發(fā)酵液中其它雜質(zhì)分離的目的.應(yīng)用了正交試驗(yàn)優(yōu)化雙水相體系提取γ-PGA的系統(tǒng)組成以及操作條件，從而確定了提取的最佳工藝.

1材料與方法

1.1材料與試劑

無(wú)水乙醇、異丙醇、磷酸氫二鉀、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水硫酸鈉(分析純，天津市天利化學(xué)試劑有限公司)；正丙醇(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；γ-聚谷氨酸發(fā)酵液(實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制得，發(fā)酵液中γ-PGA的含量為10.17 g/L).

1.2儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)；pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；快速混勻器(上海浦東物理光學(xué)儀器廠(chǎng)).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1繪制相圖

配制濃度為20%(w/w)的有機(jī)溶劑溶液和12%(w/w)的無(wú)機(jī)鹽溶液.向25 mL刻度試管中加入一定量的有機(jī)溶劑溶液，再逐滴加入鹽溶液，直至溶液渾濁;然后逐滴加入水，直至溶液澄清，計(jì)算此時(shí)系統(tǒng)中有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽的濃度;再加入鹽溶液使溶液渾濁，如此反復(fù)操作，直至溶液不出現(xiàn)渾濁或澄清.以鹽濃度為橫坐標(biāo)、有機(jī)溶劑濃度為縱坐標(biāo)，繪制雙水相相圖.

圖1為不同有機(jī)溶劑/鹽雙水相體系的相圖.

(a)乙醇/磷酸氫二鉀(硫酸鈉、碳酸鈉)雙水相系統(tǒng)相圖

(b)正丙醇/磷酸氫二鉀(硫酸鈉、碳酸鈉)雙水相系統(tǒng)相圖

(c)異丙醇/磷酸氫二鉀(硫酸鈉、碳酸鈉)雙水相系統(tǒng)相圖圖1　不同有機(jī)溶劑/鹽雙水相系統(tǒng)相圖

1.3.2雙水相體系制備

根據(jù)相圖，確定用于提取γ-PGA的雙水相體系中兩相的大致范圍.在25 mL刻度試管中，按照計(jì)算量依次加入有機(jī)溶劑溶液、無(wú)機(jī)鹽溶液、發(fā)酵液等，用蒸餾水補(bǔ)足至20 g，振蕩混合，靜置分相.

1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)

采用正丙醇/碳酸鈉雙水相體系提取γ-PGA的目的是彌補(bǔ)傳統(tǒng)提取方式的缺點(diǎn).實(shí)驗(yàn)中以提取率作為考察指標(biāo)(同時(shí)適當(dāng)考慮分配系數(shù))，考察了各因素對(duì)γ-PGA提取效果的影響，應(yīng)選擇適宜的操作條件.

(1)不同雙水相體系對(duì)γ-PGA提取率的影響

選擇20%無(wú)水乙醇、正丙醇、異丙醇等和12%磷酸氫二鉀、硫酸鈉、碳酸鈉等進(jìn)行兩兩組合，組成9組雙水相體系.靜置分相后，測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度，并計(jì)算提取率.

(2)正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

在碳酸鈉濃度為12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度25 ℃、pH 9.5、分相時(shí)間2.5 h時(shí)，正丙醇的濃度依次為15%、18%、21%、24%、27%、30%、33%等，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度，計(jì)算提取率和分配系數(shù)，并選取適宜的正丙醇濃度.

(3)碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

在正丙醇濃度為18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度25 ℃、pH 9.5、分相時(shí)間2.5 h時(shí)，碳酸鈉的濃度依次為9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%等，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度，計(jì)算提取率和分配系數(shù)，并選取適宜的碳酸鈉濃度.

(4)溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

在正丙醇濃度為18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉濃度為14%、pH 9.5、分相時(shí)間2.5 h時(shí)，溫度依次為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃等，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度，計(jì)算提取率和分配系數(shù)，并選取適宜的溫度.

(5)pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響

在正丙醇濃度為18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉濃度為14%、溫度40 ℃、分相時(shí)間2.5 h時(shí)，pH依次為9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5等，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定上下相中γ-PGA的濃度，計(jì)算提取率和分配系數(shù)，并選取適宜的pH值.

1.3.4正交試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)因素和水平，再做正交試驗(yàn)以確定最佳組合，最終確定最佳系統(tǒng)組成和操作條件.

1.3.5分析方法

γ-聚谷氨酸的測(cè)定：CTAB濁度法[17].

1.3.6計(jì)算

(1)相比:R=Vt/Vb，其中Vt為上相體積(mL);Vb為下相體積(mL).

(2)分配系數(shù):K=Ct/Cb，其中Ct為上相中γ-PGA的濃度(g/L);Cb為下相中γ-PGA的濃度(g/L).

(3)提取率:Y= 1 / (1+RK),其中K為分配系數(shù).

2結(jié)果與討論

2.1γ-PGA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和回歸方程

在235 nm處分別測(cè)定8μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL、40μg/mL、48μg/mLγ-PGA標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，得到回歸方程為Y= 0.017 75X+0.047 93，R2=0.997 49.

2.2不同雙水相體系對(duì)γ-PGA提取率的影響

不同雙水相體系對(duì)γ-PGA的提取率如圖2所示.從圖2可以看出，乙醇/碳酸鈉體系不分相，乙醇/硫酸鈉和乙醇/磷酸氫二鉀體系的提取率相差不大，異丙醇和三種鹽組成的體系提取率相差也不大，正丙醇/磷酸氫二鉀體系的提取率最低，正丙醇/碳酸鈉體系的提取率最高，達(dá)到96.3%.因此,選擇正丙醇/碳酸鈉體系進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn).

1.乙醇-碳酸鈉;2.乙醇-硫酸鈉;3.正丙醇-碳酸鈉;4.正丙醇-硫酸鈉;5.正丙醇-磷酸氫二鉀；6.異丙醇-碳酸鈉；7.異丙醇-硫酸鈉；8.異丙醇-磷酸氫二鉀圖2　不同雙水相系統(tǒng)對(duì)γ-PGA提取率的影響

2.3正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖3所示.由圖3可知，總體上看提取率Y和分配系數(shù)K都隨著正丙醇濃度的增加呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，在正丙醇濃度為18%時(shí)體系的提取率達(dá)到最大.有機(jī)溶劑/鹽雙水相體系的分相過(guò)程是有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程,隨著正丙醇濃度的增加，上相中水的含量下降，γ-PGA更易分配于下相，因此分配系數(shù)K減小,但是由于相比一直增加，所以提取率Y呈現(xiàn)下降趨勢(shì).因此，確定正丙醇濃度為18%.

柱形圖：分配系數(shù)K；折線(xiàn)圖：提取率Y圖3　正丙醇濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

2.4碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖4所示.由圖4可知，提取率隨碳酸鈉濃度變化的總體趨勢(shì)是先增大后減小，在碳酸鈉濃度為14%時(shí)，提取率最大.其原因是隨著碳酸鈉濃度的增加，水合能力增強(qiáng)，下相的含水量增大，γ-PGA更易分配于下相，分配系數(shù)減小，提取率增大.因此,可確定碳酸鈉的濃度為14%.

柱形圖：分配系數(shù)K；折線(xiàn)圖：提取率Y圖4　碳酸鈉濃度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

2.5溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖5所示.由圖5可以看出，當(dāng)溫度大于40 ℃后，分配系數(shù)增加，提取率減小；在40 ℃時(shí)分配系數(shù)最小，提取率最大.這是因?yàn)闇囟仍黾邮贵w系的黏度降低有利于分相，進(jìn)而影響γ-PGA的分配.而且，溫度還影響γ-PGA的溶解度，隨著溫度的升高，γ-PGA的溶解度增大，當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)，下相中γ-PGA已經(jīng)達(dá)到飽和，濃度基本保持不變，所以提取率和分配系數(shù)變化的幅度較小.因此，選擇溫度為40 ℃.

柱形圖：分配系數(shù)K；折線(xiàn)圖：提取率Y圖5　溫度對(duì)γ-PGA分配行為的影響

2.6pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響

pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響如圖8所示.由圖8可知，當(dāng)pH>10時(shí)，體系的提取率顯著降低.這是因?yàn)棣?PGA是由帶負(fù)電荷的谷氨酸單體組成，溶液pH的改變將影響?hù)然慕怆x平衡，以及其與雙水相體系的靜電效應(yīng)，從而影響γ-PGA的分配結(jié)果.在堿性環(huán)境下，γ-PGA帶負(fù)電，且pH越高，γ-PGA解離為負(fù)二價(jià)狀態(tài)存在的比例越高，從而使之更難分配到電位為負(fù)的下相，所以分配系數(shù)增加，萃取率減?。划?dāng)pH減小時(shí)，負(fù)二價(jià)狀態(tài)存在的比例減少，體系的相間電位差減小，提取率增大.因此，選擇pH值為10.

柱形圖：分配系數(shù)K；折線(xiàn)圖：提取率Y圖6　pH對(duì)γ-PGA分配行為的影響

2.7正交試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)，確定正丙醇濃度、碳酸鈉濃度、溫度和pH四個(gè)因素，并分別選取相應(yīng)的水平值進(jìn)行正交試驗(yàn)，且以提取率作為主要的研究對(duì)象.正交試驗(yàn)的因素水平表如表1所示.

表1　因素水平表

表2為正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析表.其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH的極差最大，對(duì)γ-PGA提取率的影響最大，溫度對(duì)γ-PGA提取率的影響顯著性高于碳酸鈉的影響，正丙醇濃度的影響最小.故各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序依次為DCBA.因?yàn)檎嫉臉O差最小，故以正丙醇濃度為誤差，做方差分析，其結(jié)果如表3所示.

表3為正交試驗(yàn)方差分析表.由表3可知，在給定的置信度α= 0.05時(shí)，F(xiàn)α(2，2)=19.只有pH的F比大于F臨界值，表明只有pH對(duì)提取率有顯著影響.影響γ-PGA提取率的正交試驗(yàn)各因素的最優(yōu)組合為A2B3C2D2.

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析表

表3　正交試驗(yàn)方差分析表

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀(guān)分析可知，影響γ-PGA提取率的正交試驗(yàn)各因素水平的最佳組合為A2B3C2D2，即正丙醇濃度18%、碳酸鈉濃度14%、溫度40 ℃、pH10.表4為驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果.由表4可知，在最佳提取條件下,γ-PGA的提取率為98.07%，高于正交試驗(yàn)中所得的最優(yōu)結(jié)果97.95%(見(jiàn)表2所示).因此,確定雙水相體系的組成為:正丙醇濃度18%、碳酸鈉濃度14%、溫度40 ℃、pH10.

表4　驗(yàn)證性試驗(yàn)

3結(jié)論

本文實(shí)現(xiàn)了直接從發(fā)酵液中提取γ-PGA，菌體富集在上相，γ-PGA聚集在下相.通過(guò)正交試驗(yàn)得到了最佳提取條件為：雙水相系統(tǒng)組成為正丙醇濃度18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、碳酸鈉14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、溫度40 ℃、pH10，其γ-PGA的提取率達(dá)98.07%.這一結(jié)果比正交試驗(yàn)中的最大值提高了1.22%,為γ-PGA的分離純化提供了一種新方法.

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Study on n-propanol/sodium carbonate aqueous two-phase

system to extract polyγ-glutamic acid from fermentation broth

ZHANG Zhi-wei， LIU Ting， HAN Fei

(College of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:The work attempted to study and optimize the aqueous two-phase systems (n-propanol/sodium carbonate) to extract γ-PGA from fermentation broth,in which γ-PGA was enriched in salt phase,the effect of several parameters such as concentration of phase forming components (n-propanol and sodium carbonate),temperature and pH on the extraction rate and partition coefficient of γ-PGA were studied.Orthogonal experiment design was applied to determine the optimum technical conditions for extraction.The results showed that the optimum extraction condition of n-propanol/sodium carbonate aqueous two-phase system were 18%(w/w) n-propanol and 14%(w/w) sodium carbonate at 40 ℃ and pH=10.Under the optimal condition,the extraction rate was 98.07%.In conclusion, the method has good reliability.

Key words:aqueous two-phase system; extraction; poly γ-glutamic acid; orthogonal experiment design

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ922+.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2015)05-0130-05

作者簡(jiǎn)介:張智維(1967-)，女，陜西西安人，高級(jí)工程師，研究方向：食品微生物發(fā)酵

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009JM2005)； 陜西省教育廳專(zhuān)項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(09KJ373)

收稿日期:*2015-05-19