微波法輔提靈芝多糖及體外抗氧化研究

董文賓， 王世鵬

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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微波法輔提靈芝多糖及體外抗氧化研究

董文賓， 王世鵬

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：本實(shí)驗(yàn)采用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)微波法輔提靈芝多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以抗壞血酸為陽性對(duì)照對(duì)靈芝粗多糖體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈芝經(jīng)蒸餾水預(yù)浸泡1 h后在溫度60 ℃、料水比1∶40、微波功率100 W、微波時(shí)間30 min的提取條件下多糖得率最高.靈芝粗多糖體外抗氧化活性試驗(yàn)證明靈芝粗多糖有一定的體外抗氧化活性且與濃度呈正相關(guān)，但總體不及抗壞血酸.當(dāng)靈芝多糖濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH和O2-·的清除能力最大分別為62.07%和 55.39%，說明其對(duì)活性氧自由基的清除具有選擇性，可能與其粗多糖中的雜質(zhì)、多糖結(jié)構(gòu)和清除機(jī)理有關(guān).

關(guān)鍵詞：靈芝多糖； 微波法； 體外抗氧化

0引言

靈芝(Ganoderma Lucidum)又稱為靈芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株，寄生于櫟及其它闊葉樹根部的多孔菌科真菌[1].現(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-5]證實(shí)靈芝具有增強(qiáng)機(jī)體免疫，提高機(jī)體耐缺氧能力，抑制腫瘤，保肝護(hù)肝清除自由基以延緩衰老等多方面的藥理活性.本實(shí)驗(yàn)所用靈芝孢子粉經(jīng)鑒定為赤芝，靈芝多糖含量為2.2%～2.6%.

靈芝多糖因可溶于水，目前多采用水、稀堿、稀酸以及二甲基亞砜作為溶劑提取靈芝多糖[6-8].水浸提法多糖得率低且耗時(shí)長，采用稀酸、稀堿浸提時(shí)可提升多糖得率,但對(duì)多糖的組織結(jié)構(gòu)損害較大，采用二甲基亞砜作為浸提溶劑時(shí)二甲基亞砜價(jià)格昂貴且對(duì)人體有害,在實(shí)際應(yīng)用中阻力較大[9].研究顯示采用微波法提取靈芝多糖具有得率高，對(duì)多糖組織結(jié)構(gòu)損傷小、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[10,11].本實(shí)驗(yàn)通過單因素及正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化微波法提取多糖工藝.

靈芝多糖是靈芝中的一種重要的活性成分，逐漸成為研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過檢測靈芝多糖的體外抗氧化活性，以期對(duì)靈芝多糖的藥用和保健價(jià)值做出判斷，并促進(jìn)靈芝多糖產(chǎn)品進(jìn)一步開發(fā).

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑

(1)材料：靈芝孢子粉購于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心，該靈芝經(jīng)鑒定為赤芝.

(2)試劑：丙酮、濃硫酸、L-抗壞血酸、30%雙氧水(H2O2)、水楊酸、Tris、鄰苯三酚、三氯乙酸、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)、亞硝酸鈉(NaNO2)、鹽酸-α-奈胺、對(duì)氨基苯磺酸，試劑均為分析純.

1.2實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

TDA-8002-電熱恒溫水浴鍋(北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司)；BS224S-電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；WFJ2100型-可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)；TDL-4-臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)；DHG-9243BS-Ⅲ-電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；SHB-3-真空抽濾機(jī)(鄭州長城科工貿(mào)有限公司).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1靈芝多糖的制備工藝

靈芝孢子粉→蒸餾水浸泡→微波預(yù)處理→離心取上清液→乙醇沉淀→靈芝多糖.

1.3.2靈芝多糖的工藝優(yōu)化

(1)提取方法單因素試驗(yàn)

考察微波功率、溫度、料水比、微波時(shí)間對(duì)微波法提取靈芝粗多糖得率的影響.

(2)提取方法正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，通過L934正交試驗(yàn)選擇浸提溫度、料水比、微波功率、微波對(duì)微波法提取靈芝粗多糖進(jìn)行條件優(yōu)化.

1.3.3靈芝多糖得率的測定

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)《中國藥典》規(guī)定的靈芝多糖硫酸蒽酮比色法檢測靈芝多糖得率，具體采用90%硫酸-蒽酮法水浴10 min測定多糖提取率[12].

1.3.4靈芝粗多糖的抗氧化活性研究

(1)粗多糖對(duì)羥基自由基(·OH)清除能力的研究

將粗多糖用蒸餾水溶解，配成2 mg/mL溶液，并進(jìn)行梯度稀釋.在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，待測樣液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，然后加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻，放入37 ℃水浴鍋中加熱30 min后取出，待到室溫后于510 nm處測其吸光度(Ai)；另取2支試管，分別做空白(Ac)和樣品對(duì)照(Aj).以Vc做為陽性對(duì)照，測定在相同條件下對(duì)·OH的清除能力進(jìn)行測定.按下式計(jì)算各待測樣品對(duì)羥自由基(·OH)的清除率[13].

羥基自由基(·OH)清除率(%)=

式中：Ai—表示樣液與水楊酸溶液混合液的吸光值；Aj—表示樣液與空白溶劑混合液的吸光值；Ac—表示水楊酸溶液與空白溶劑混合液的吸光值.

(2)粗多糖對(duì)超氧陰離子(O2-·)自由基清除能力的研究

將粗多糖用蒸餾水溶解，配成2 mg/mL溶液，并進(jìn)行梯度稀釋.取試樣100μL，0.1 mol/L的Tris-HCl 1.8 mL和蒸餾水1.0 mL，放入同一試管中，25 ℃水浴保溫10 min，加入同樣溫浴的3 mmol/L的鄰苯三酚100μL，迅速混合，然后每隔30 s測定在325 nm處的吸光值，記為A樣本.以10 mmol/L的HCl溶液配制空白管作為對(duì)照，記為A對(duì)照.得出A325隨時(shí)間變化的曲線，重復(fù)三次，取平均值.以Vc作為陽性對(duì)照，進(jìn)行相應(yīng)的測定.按照下列公式計(jì)算待測樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力[14-16].

(3)粗多糖還原能力的研究

將粗多糖用蒸餾水溶解，配成2 mg/mL溶液，并作梯度稀釋.取0.5 mL不同濃度的樣品，加入1.25 mL磷酸緩沖液(PBS，pH=6.6，0.2 mol/L)和1.25 mL 1%(w/v)K3Fe(CN)6，在50 ℃下反應(yīng)20 min，而后加入1.25 mL的三氯乙酸(10%，w/v)，在6 000 r/min下離心10 min，取上清夜3.0 mL與0.30 mL所配的FeCl3(0.1%，w/v)混合搖勻后，在700 nm處測定溶液的吸光度，重復(fù)以上操作3次,取平均值[14,15,17].以Vc做為陽性對(duì)照，測定其總還原力.

2結(jié)果與討論

2.1微波法提取靈芝粗多糖的條件優(yōu)化

2.1.1微波功率對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

在溫度50 ℃，料水比為1∶30，超聲時(shí)間20 min,考察微波功率分別為0 W、100 W、300 W、500 W、700 W時(shí)對(duì)靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表1所示.

表1　微波功率對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

從表1可看出，隨著微波功率的增加，靈芝多糖的得率也隨之增大，當(dāng)微波功率達(dá)到500 W時(shí)多糖提取率最高，但當(dāng)微波功率為700 W時(shí)多糖得率反而降低，這可能是微波功率過高使靈芝多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，說明微波功率對(duì)多糖得率有較大影響，最佳的微波功率條件是500 W.

2.1.2溫度對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

在微波功率為500 W，料水比為1∶30，超聲時(shí)間20 min條件下, 考察溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃時(shí)對(duì)靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表2所示.

表2　溫度對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

從表2可看出，隨溫度升高，多糖分子移動(dòng)加快利于溶出，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)多糖得率最高，但當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，可能由于溫度過高對(duì)多糖組織結(jié)構(gòu)造成破壞影響多糖的提取.

2.1.3料液比對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

在溫度60 ℃，微波功率為500 W，超聲時(shí)間20 min，考察料水比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50對(duì)靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表3所示.

表3　料水比對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

從表3可看出，隨著加水量的增大多糖越易溶出，但加水量過高會(huì)使?jié)饪s程序更加繁瑣.當(dāng)料水比為1∶40時(shí)多糖得率最高.

2.1.4微波時(shí)間比對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

在溫度50 ℃，料水比為1∶40，微波功率為500 W，考察超聲時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min對(duì)靈芝粗多糖得率的影響，結(jié)果如表4所示.

表4　微波時(shí)間比對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

從表4可看出，微波時(shí)間為30 min時(shí)多糖得率最高，之后隨時(shí)間的延長多糖得率下降，時(shí)間的延長會(huì)對(duì)靈芝組織產(chǎn)生破壞利于多糖提取、但多糖結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化.

2.2正交試驗(yàn)確定微波法提取靈芝粗多糖的最佳條件

通過單因素試驗(yàn)每個(gè)因素選擇三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示.

表5　微波法提取靈芝多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可看出，微波法提取靈芝粗多糖的影響因素從小到大依次為D

2.3靈芝粗多糖的抗氧化活性測定

2.3.1靈芝粗多糖對(duì)·OH自由基的清除能力測定

靈芝粗多糖對(duì)·OH自由基的清除能力測定結(jié)果見圖1所示.

圖1　靈芝粗多糖對(duì)·OH自由基的清除能力測定

·OH一直被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的活性氧自由基，是造成人體有機(jī)體過氧化損傷的主要因素，因此，對(duì)于清除·OH對(duì)人體的健康有非常重要的作用.由圖1可以看出，雖然靈芝多糖對(duì)其有一定的清除能力，且隨著濃度的增大清除率越來越大，增長速率也越來越快，但總體來說清除能力較弱.在試驗(yàn)范圍內(nèi)，靈芝粗多糖對(duì)·OH的清除能力最大為62.07%，而在與陽性對(duì)照Vc對(duì)比可知，其開始清除率增長速率較快，但隨著濃度增大增長緩慢，在試驗(yàn)范圍內(nèi)最大清除率為79.76%，因此，同濃度下靈芝粗多糖對(duì)·OH清除能力較弱.

2.3.2靈芝粗多糖對(duì)O2-·自由基的清除能力測定

靈芝粗多糖對(duì)O2-·自由基的清除能力結(jié)果見圖2所示.

圖2　靈芝粗多糖對(duì)O2-·自由基的清除能力測定

O2-·在人體中含量過多會(huì)引起機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損傷.不同濃度的靈芝粗多糖溶液加入到O2-·發(fā)生體系后，如圖2所示，隨著濃度的增大，清除率增長緩慢，濃度最大時(shí)清除率達(dá)到55.39%.與陽性對(duì)照Vc比較，Vc在試驗(yàn)條件下，當(dāng)濃度較小時(shí)，清除率增長較慢，當(dāng)濃度大于0.5 mg/mL時(shí)清除率增長較快，清除率較高，最大能達(dá)到69.05%.可見，同等濃度下，靈芝粗多糖溶液對(duì)O2-·的清除能力很弱，與Vc相差較大.

2.4粗多糖的還原能力的測定

粗多糖的還原能力測定結(jié)果見圖3所示.

圖3　靈芝粗多糖的還原能力測定

物質(zhì)的還原能力可以反映其潛在的抗氧化活性，具有較好還原能力的物質(zhì)通常是電子供體，能夠清除脂質(zhì)過氧化過程中的中間產(chǎn)物.由圖3可看出，靈芝粗多糖的總的還原力一般，隨著濃度的增大，總還原力增大，且增大速率越來越快.與陽性對(duì)照Vc相比可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，靈芝粗多糖的還原能力與Vc的還原能力增長率相似，且總的還原力相差不大.

3結(jié)論

(1)通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)微波法提取靈芝粗多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果為在溫度60 ℃、料水比1∶40、微波功率100 W、微波時(shí)間30 min的條件下對(duì)靈芝進(jìn)行預(yù)處理后，多糖提取率最高.

(2)實(shí)驗(yàn)中體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，靈芝粗多糖對(duì)·OH的清除能力最大為62.07%，對(duì)O2-·清除能力可達(dá)到55.39%.

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Research in auxiliary mention and antioxidant in vitro

of ganoderma lucidum polysaccharides

DONG Wen-bin， WANG Shi-peng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:In this paper,single factor and orthogonal experiments were designed to optimize the microwave extraction conditions of ganoderma lucidum polysaccharides from the aspects of temperature,material-water ratio,microwave power,microwave extraction time in this paper.Results showed that after pre-soaking in distilled water for an hour,when the temperature,material-water ratio,microwave power and microwave extraction time was respectively 60 ℃,1∶40,100 W,30 min,the obtaining rate of polysaccharides was the highest.It proved that ganoderma crude polysaccharides had some reducing ability and scavenging capacity of different radicals,which meant it had a certain selectivity of scavenging free radical.It might be related to impurities in the crude polysaccharides,polysaccharide structure and scavenging mechanisms.

Key words:ganoderma lucidum polysaceharide； microwave extraction； antioxidant

中圖分類號(hào)：S646.19

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2015)05-0115-05

作者簡介:董文賓(1951-)，男，陜西寶雞人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：功能食品

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013KTZB02-01-04)

收稿日期:*2015-07-21