哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白結(jié)構(gòu)與信號(hào)通路研究進(jìn)展

李 欣

(成都大學(xué)體育學(xué)院，四川 成都610600)

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可以感受細(xì)胞所處環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和能量狀態(tài)，是一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、能量狀態(tài)的傳感器，它處于PI3K/Akt信號(hào)通路的下游，能感受并整合經(jīng)PI3K信號(hào)通路傳遞的生長(zhǎng)因子信號(hào)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期中起非常關(guān)鍵的作用［1］．目前的研究表明，其調(diào)節(jié)作用主要集中在以下幾個(gè)方面:(1)通過影響p70S6K的活性而調(diào)控核糖體的生成;(2)通過改變4E-BP1的磷酸化狀態(tài)而調(diào)控翻譯起始復(fù)合物的功能;(3)通過影響真核延伸因子-2激酶，而調(diào)控多肽鏈的延伸［2］．

1 結(jié)構(gòu)

在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)兩種可被雷帕霉素抑制的基因:TOR1和TOR2，其編碼的雷帕霉素靶蛋白是一種高度保守的大分子蛋白，可以抵抗免疫親和蛋白-免疫抑制劑復(fù)合物(FKBP-雷帕霉素)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)．TOR1和TOR2基因編碼兩種分子量為280道爾頓，相似度70%的TOR1和TOR2蛋白，其哺乳動(dòng)物直向同源物為mTOR，mTOR蛋白與酵母TOR相比，其氨基酸序列有42%的相似，蛋白包括2 549個(gè)氨基酸和幾個(gè)保守的結(jié)構(gòu)功能域．N端包括20個(gè)連續(xù)的由37-47個(gè)氨基酸殘基組成的HEAT重復(fù)序列，分為兩簇，構(gòu)成一對(duì)反向平行α-螺旋結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)復(fù)合蛋白質(zhì)中蛋白與蛋白間的親和力［3］．

TOR蛋白在C端有一個(gè)與PI3K和肌醇磷脂4位激酶高度同源的催化功能域，其相關(guān)蛋白家族成員包括:MEC1、TEL1、RAD3、MEI-41、DNA-PK、ATM、ATR和TRRAP．．這些蛋白的C端都有一個(gè)同源的磷脂酰肌醇激酶功能域，因此被稱為PI3K-相關(guān)激酶蛋白家族．但mTOR從功能上看是還是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它還包括一個(gè)FKBP-雷帕霉素結(jié)合功能域(FRB)，該功能域可以出現(xiàn)氨基酸替換，阻止FKBP-雷帕霉素復(fù)合物與mTOR的結(jié)合，在FRB和催化功能域間存在一個(gè)約為500氨基酸序列的FAT功能域，起到支架或蛋白-蛋白作用功能域的作用．在C端還含有一個(gè)大約35個(gè)氨基酸的延伸序列:FATC功能域，該功能域?yàn)閙TOR活性所必需，去除任意一個(gè)該功能域的氨基酸都會(huì)使mTOR活性喪失［4］，F(xiàn)ATC和FAT相互作用可產(chǎn)生催化功能，在兩個(gè)功能域間，可能還存在一個(gè)陰性調(diào)節(jié)功能域NRD．其具體結(jié)構(gòu)見圖1［3］．

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，mTOR一般以兩個(gè)功能不同的復(fù)合物形式存在:mTORC1和mTORC2［5］．mTORC1時(shí)，mTOR與兩個(gè)高度保守的蛋白質(zhì)Raptor和G蛋白β亞基樣蛋白結(jié)合，Raptor是種進(jìn)化保守的分子量為150道爾頓，其與mTOR的HEAT功能域，以及p70S6K和4E-BP1上的TOR信號(hào)模序結(jié)合．Raptor可通過穩(wěn)定mTOR的正確折疊，或作為支架蛋白將底物募集到激酶功能域附近，或通過調(diào)節(jié)mTOR的細(xì)胞內(nèi)定位來介導(dǎo)mTOR對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的感受［6］．Raptor和mTOR之間的相互作用需要G蛋白β亞基樣蛋白(G protein β-subunit-like protein，GβL)，其是另一種mTOR的結(jié)合蛋白，分子量為36道爾頓，含有7個(gè)WD-40重復(fù)序列，可直接結(jié)合到mTOR的催化功能域，參與mTOR對(duì)氨基酸水平的感受．mTORC2時(shí)，mTOR與Rictor、mSIN1和GβL形成復(fù)合物．mTORC2最有特性的功能是可以磷酸化Akt的絲氨酸殘基473，而該殘基正是Akt磷酸化mTORC1的位點(diǎn)，且Akt的轉(zhuǎn)角基序蘇氨酸殘基450也需要mTORC2的磷酸化，因此，在Akt信號(hào)通路中，mTORC2位于Akt的上游，而mTORC1則位于Akt的下游［7］．

圖1 mTOR結(jié)構(gòu)示意圖

2 mTOR的上游調(diào)節(jié)因子

2．1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)mTOR的調(diào)節(jié)

當(dāng)TOR1和TOR2蛋白從出芽酵母中提取出來時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了與它們結(jié)合的蛋白質(zhì):AVO1、AVO2、AVO3、LST8和KOG1．AVO1、AVO2、AVO3只和TOR2結(jié)合，而LST8和KOG1則可與TOR1或TOR2任意單獨(dú)的結(jié)合．其結(jié)合不受雷帕霉素或營(yíng)養(yǎng)剝奪的影響．但當(dāng)mTOR-Raptor結(jié)合后，營(yíng)養(yǎng)環(huán)境對(duì)mTOR與底物結(jié)合并磷酸化的能力有顯著影響，在存在雷帕霉素或營(yíng)養(yǎng)剝奪時(shí)，mTOR基因的細(xì)胞周期停留在G0期，mTOR-GβL-Raptor與底物的結(jié)合能力喪失;而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)充裕時(shí)，Raptor與mTOR的底物間的親和力增加．值得注意的是，雷帕霉素可以導(dǎo)致Raptor與mTOR間的解離，而營(yíng)養(yǎng)剝奪則不會(huì)．

細(xì)胞內(nèi)的氨基酸水平也可以調(diào)節(jié)mTOR的活性，其中亮氨酸的作用最為顯著［8］．亮氨酸濃度的增高可以通過Rheb和AMKP，而不是生長(zhǎng)因子信號(hào)通路來增加mTOR的活性，但其控制mTOR活性的具體機(jī)制尚不明了，現(xiàn)有證明表明這可能與線粒體代謝變化相關(guān)［9］．mTOR也可通過調(diào)節(jié)氨基酸透酶的活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氨基酸濃度．ATP濃度下降或線粒體功能失調(diào)會(huì)激活A(yù)MKP，從而抑制mTOR表達(dá)［10］．在缺氧或低血糖時(shí)，細(xì)胞內(nèi)升高的腺苷單磷酸活化蛋白通過變構(gòu)作用激活A(yù)MKP，磷酸化其下游靶因子，抑制mTOR，降低ATP的消耗．AMPK也可磷酸化mTOR的負(fù)調(diào)控因子TSC2，而減弱mTOR表達(dá)．

2．2 PI3K

mTOR的活性可被生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)，胰島素和其他生長(zhǎng)因子可顯著增加mTOR敏感型的S6K和4EBP1的磷酸化程度．PI3K的激活可以使4E-BP1因胰島素引起的磷酸化程度達(dá)到最大，當(dāng)使用PI3K抑制劑渥曼青霉素和LY294002時(shí)，S6K和4EBP1的磷酸化程度降低，這些證據(jù)表明生長(zhǎng)因子引起的mTOR的激活須經(jīng)PI3K介導(dǎo)，即PI3K是mTOR上游的正性調(diào)節(jié)因子［11］．在HEK-293細(xì)胞株中，過表達(dá)的PI3K催化亞基-p110可以在缺乏生長(zhǎng)因子或胰島素時(shí)，導(dǎo)致4EBP1的磷酸化，負(fù)性調(diào)節(jié)亞基P85的過表達(dá)能抑制胰島素誘導(dǎo)的S6K的磷酸化．這些結(jié)果與PTEN缺乏后細(xì)胞中4E-BP1和p70S6K高水平磷酸化的變化是一致的．

2．3 Akt

絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶Akt是PI3K的下游效應(yīng)物，在調(diào)節(jié)mTOR活性中具有重要作用．哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)三種由不同基因編碼的Akt蛋白．Akt激活的限速步驟包括PH功能域與PI3K結(jié)合-異位至細(xì)胞膜-被PDK1磷酸化．HEK-293細(xì)胞株中過表達(dá)的完全激活形式的Akt可以在缺乏生長(zhǎng)因子和存在渥曼青霉素時(shí)，提高4E-BP1的磷酸化程度．而具有顯性負(fù)效應(yīng)的Akt可以損壞胰島素誘導(dǎo)的4E-BP1的磷酸化．這些表明Akt是mTOR的上游調(diào)控因子［12］．當(dāng)缺乏Akt1和Akt2時(shí)，p70S6K的磷酸化下降程度少于4E-BP1，提示p70S6K的磷酸化主要依賴于Akt3，而4E-BP1的磷酸化更依賴于Akt3．但一些實(shí)驗(yàn)對(duì)Akt作為mTOR上游正性調(diào)節(jié)因子的地位表示了懷疑:在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中p70S6K的磷酸化與Akt的活性并不總是保持一致;Akt作用于mTOR的機(jī)制仍不明了，mTOR擁有兩個(gè)臨近的磷酸化位點(diǎn)，蘇氨酸殘基2446和絲氨酸殘基2448，Akt可磷酸化絲氨酸殘基2448，而這兩個(gè)殘基均位于mTOR的負(fù)性調(diào)節(jié)功能域中，且這兩個(gè)氨基酸被丙氨酸替換后對(duì)mTOR的活性沒有影響．

2．4 TSC1/TSC2

結(jié)節(jié)性硬化癥的的錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白和結(jié)節(jié)蛋白是由結(jié)節(jié)性硬化癥中腫瘤抑制突變基因TSC1和TSC2編碼的，這兩種蛋白質(zhì)通過N端連接，組成一個(gè)異二聚體復(fù)合物，形成一個(gè)抑制mTORC1活性的功能單位，是mTOR的上游負(fù)調(diào)控因子．該二聚體缺乏時(shí)，p70S6K和4E-BP1的磷酸化程度均增高，可產(chǎn)生與PTEN突變相似的細(xì)胞和器官體積增大的效果，而該二聚體過表達(dá)時(shí)，p70S6K和4E-BP1的磷酸化程度均降低．TSC2含有一個(gè)GTP酶激活蛋白(GAP)的功能域域，刺激小G蛋白R(shí)heb內(nèi)在的GTP酶活性，從而使Rheb轉(zhuǎn)化為GDP結(jié)合的滅活狀態(tài)．而當(dāng)Rheb是GTP結(jié)合狀態(tài)時(shí)，它可激活mTORC1．在受到生長(zhǎng)因子作用時(shí)，活化的Akt可以直接磷酸化TSC2的氨基酸殘基，而使其失去抑制Rheb作用的活性來激活mTOR．但過表達(dá)的TSC2發(fā)生α替代變異時(shí)，可阻斷Akt介導(dǎo)的mTORC1的激活．這些表明Akt介導(dǎo)的TSC2的磷酸化對(duì)調(diào)節(jié)mTORC1活性十分重要［13］．Rheb是TSC2GTP酶的一個(gè)直接底物．營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)，Rheb處于活化狀態(tài)，與GTP結(jié)合，并與包括mTOR在內(nèi)的多種蛋白發(fā)生作用．而營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，TSC2的GTP酶激活蛋白域誘導(dǎo)Rheb水解失活形成Rheb-GDP，從而抑制mTOR活性．總之，Rheb是位于TSC1/TSC2復(fù)合物下游，mTOR的正調(diào)控因子．同時(shí)，TSC2是細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比例感受器AMPK的直接底物，ATP水平下降時(shí)，磷酸化狀態(tài)的AMPK能磷酸化并激活TSC2，從而通過Rheb抑制mTOR信號(hào)［14］．

3 mTOR的下游效應(yīng)物

mTOR受氨基酸或生長(zhǎng)因子刺激時(shí)，可以經(jīng)激活p70S6K和抑制4EBP-1來控制翻譯起始，p70S6K的激活可以導(dǎo)致核糖體蛋白S6的磷酸化，從而使5'TOP mRNAs翻譯，這種mRNA含有大量的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可以編碼大部分的核糖體蛋白和翻譯元件．因此，通過控制5'TOP mRNAs翻譯，mTOR上調(diào)了翻譯效率．4EBP-1是翻譯抑制物，可被mTOR磷酸化滅活，從而與eIF4E脫離，eIF4E可與帽結(jié)構(gòu)結(jié)合，開始帽依賴性翻譯．

3．1 4E-BPs

eF4E和eIF4G的相互作用受4E-BPs調(diào)控，哺乳動(dòng)物的4E-BPs是由3種不同的基因編碼而成的低分子量蛋白:4E-BP1、4EB-P2和4E-BP3．低磷酸化的4E-BPs與eIF4E有著高度的親和力，而高磷酸化的4E-BPs則不與eIF4E作用［15］．4E-BPs的磷酸化位點(diǎn)包括:蘇氨酸殘基37、蘇氨酸殘基46、絲氨酸殘基65、蘇氨酸殘基70、蘇氨酸殘基83、絲氨酸殘基101和絲氨酸殘基112．4E-BPs從eIF4E上脫落時(shí)，其殘基磷酸化按蘇氨酸殘基37、蘇氨酸殘基46、絲氨酸殘基65、蘇氨酸殘基70的順序進(jìn)行．mTOR只磷酸化絲氨酸殘基65時(shí)，4E-BP1無(wú)法與eIF4E分離，但當(dāng)用一個(gè)氨基酸去替代絲氨酸殘基65時(shí)，會(huì)大大減弱4E-BP1與eIF4E的結(jié)合，因此其余殘基的磷酸化協(xié)同會(huì)加快4E-BP1與eIF4E的解離．

3．2 p70S6K

哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有兩種由不同基因編碼的S6激酶，S6激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，是TOR蛋白的直接靶物質(zhì)，S6激酶通過作用于其直接下游效應(yīng)因子S6蛋白，增加mRNA的翻譯效率來控制細(xì)胞生長(zhǎng)．S6蛋白的磷酸化與5‘TOP mRNA的翻譯效率相關(guān)，但目前的研究表明S6蛋白并不是調(diào)節(jié)5‘TOP mRNA翻譯的唯一因子．eIF4B也是S6K的靶物質(zhì)，eIF4B對(duì)RNA解旋酶eIF4A具有調(diào)節(jié)作用，其絲氨酸殘基422是S6K的特異性磷酸化位點(diǎn)，因此eIF4B可能是S6K在翻譯和細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要調(diào)節(jié)因子，由于eIF4B能幫助eIF4A打開RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以eIF4B的磷酸化程度增強(qiáng)能提高具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯效率．

3．3 eIF4G

eIF4G是一個(gè)支架蛋白，在組裝核糖體起始復(fù)合物中起著關(guān)鍵作用．eIF4G包括eIF4G1和eIF4G2，均包括三個(gè)通過鉸鏈區(qū)連接的功能和結(jié)構(gòu)域．兩者都是磷蛋白，但他們的磷酸化調(diào)節(jié)方式不同，當(dāng)受到血清、胰島素和生長(zhǎng)因子的刺激時(shí)，eIF4G1的磷酸化程度高于eIF4G2，eIF4G1包括兩簇磷酸化位點(diǎn)，一個(gè)位于N端的絲氨酸殘基314，另一個(gè)在蛋白中間的鉸鏈區(qū)，包括絲氨酸殘基1148、1188和1232，對(duì)PI3K和mTOR抑制劑敏感．當(dāng)eIF4G被mTOR磷酸化時(shí)，發(fā)生構(gòu)象改變，活性增加［16］．

3．4 真核延伸因子-2激酶

mTOR對(duì)翻譯的調(diào)節(jié)中還存在其它靶蛋白:真核生物延伸因子-2激酶．真核延伸因子-2蘇氨酸殘基56的磷酸化可導(dǎo)致失活，雷帕霉素能通過對(duì)真核延伸因子-2激酶的影響來抑制真核延伸因子-2的去磷酸化．雷帕霉素磷酸化真核延伸因子-2激酶的位點(diǎn)為絲氨酸殘基78位，359和366［17］．

4 研究展望

mTOR不僅在細(xì)胞生長(zhǎng)中控制mRNA翻譯，調(diào)控蛋白質(zhì)合成，而且還參與刺激基因的轉(zhuǎn)錄過程．營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足時(shí)，mTOR能通過將一些受營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子滯留在細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制這些饑餓特異性基因的轉(zhuǎn)錄．通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子STAT3一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，其存在TOR識(shí)別基序(TOR signaling)，提示其可能被Raptor募集，而后被mTOR磷酸化．目前的研究已證實(shí)聚合酶I特異性轉(zhuǎn)錄因子上游結(jié)合因子UBF和轉(zhuǎn)錄起始因子1A也是受mTOR調(diào)節(jié)的靶物質(zhì)．mTOR可以通過UBF來刺激rRNA的轉(zhuǎn)錄．

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