等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的應(yīng)用

◎蘭 瑩

（四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610021）

金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)稱金葡菌，是微球菌科葡萄球菌屬，分布廣泛。金葡菌能夠在人體的黏膜、鼻咽等處寄殖，因此在食品加工生產(chǎn)過(guò)程中，極易通過(guò)加工、銷售等人員帶菌導(dǎo)致污染，最終造成食物中毒事件的出現(xiàn)。通常情況下，容易遭受金葡菌污染度的食品包括：生/熟肉、乳和乳制品、蛋和蛋制品等等。當(dāng)前，金葡菌已經(jīng)成被列入我國(guó)食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)設(shè)備

PCR 擴(kuò)增儀；5417R離心機(jī)；SPX-150B-Z 生化培養(yǎng)箱；DNA/RNA/蛋白分析儀；UVIpro 凝膠成像系統(tǒng)[1]。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、Baird-Parker 氏培養(yǎng)基、增菌劑、7.5%氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Petrifilm RSA.Count Plate、Baird-parker+RPFAgar。

1.1.3 生化試劑

LAMP反應(yīng)試劑、PCR 反應(yīng)試劑、引物、TE 緩沖液、TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、配制瓊脂糖凝膠、500 mmol/LEDTA溶液、1 mol/LTris-HCl、10%SDS等等。

1.1.4 試驗(yàn)樣品

通過(guò)無(wú)菌操作的方式在當(dāng)?shù)刂饕袌?chǎng)購(gòu)買200份的試驗(yàn)樣品，其分別為鮮牛乳、牛肉、雞肉、豬肉以及其余肉制品，其中牛乳和肉制品分別準(zhǔn)備60份和50份，其余均為30份。

1.2 試驗(yàn)方法

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)金葡菌的靈敏度以及人工污染檢出限的有效對(duì)比，本試驗(yàn)分別采取了等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（LAMP）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）。

1.2.1 LAMP 試驗(yàn)方法

LAMP反應(yīng)是在水浴鍋內(nèi)開展的，先令其在64℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間控制在20分鐘，再令其在80℃水浴鍋內(nèi)繼續(xù)反應(yīng)，10分鐘后反應(yīng)結(jié)束。

反應(yīng)完成后，用肉眼對(duì)反應(yīng)體系濁度的變化情況進(jìn)行觀測(cè)，并通過(guò)高速離心的方式，驗(yàn)證管底是否存在白色的焦磷酸鎂沉淀。此外，還需使用5μL的擴(kuò)增產(chǎn)物和1μL6×lodding buffer進(jìn)行混合，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行觀察和成像，看是否存在梯形條帶，LAMP 反應(yīng)是否已經(jīng)發(fā)生[2]。

1.3 PCR試驗(yàn)方法

PCR的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程主要是在PCR 儀內(nèi)開展的，第一步預(yù)變性94℃，保持4分鐘；第二步是變性94℃，保持1分鐘；第三步是退火58℃，保持0.5分鐘；第四步延伸72℃，保持1.5分鐘，循環(huán)35；第五步延伸72℃，保持3.5分鐘。

使用5μL的PCR 產(chǎn)物和1μL6×lodding buffer進(jìn)行混合，過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行觀察和成像，

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)金葡菌靈敏度分析

在本試驗(yàn)中，原始菌液的濃度是2.5×109CFU/mL，將其稀釋了108倍后，通過(guò)LAMP進(jìn)行反應(yīng)，依舊發(fā)現(xiàn)存在白色的焦磷酸鎂沉淀，能夠看到梯形條帶；當(dāng)菌液的濃度稀釋到了109倍時(shí)，則沒(méi)有任何沉淀和梯形條帶。對(duì)于PCR反應(yīng)而言，當(dāng)菌液的濃度稀釋到106倍時(shí)，還存在特異性條帶，繼續(xù)進(jìn)行稀釋，則沒(méi)有任何反應(yīng)。如下圖1所示即為L(zhǎng)AMP和PCR檢測(cè)金葡菌敏感性比較示意圖。

圖1 LAMP和PCR檢測(cè)金葡菌敏感性比較示意圖

根據(jù)上述結(jié)果，可以得出LAMP反應(yīng)檢測(cè)金葡菌靈敏度更高。

2.2 食品中金葡菌檢出限分析

在試驗(yàn)中，使用濃度2.06×109CFU/mL的菌液對(duì)食品進(jìn)行人工污染，然后再將金葡菌的 DNA提取出來(lái)，使用LAMP與PCR方法對(duì)進(jìn)行試驗(yàn)。

當(dāng)菌液濃度稀釋到了107倍時(shí)，通過(guò)LAMP進(jìn)行反應(yīng)，依舊發(fā)現(xiàn)存在白色的焦磷酸鎂沉淀，能夠看到梯形條帶；當(dāng)菌液的濃度稀釋到了108倍時(shí)，則沒(méi)有任何沉淀和梯形條帶，因此LAMP法對(duì)人工食品中金葡菌檢出限是2.06×102CFU/mL。對(duì)于PCR反應(yīng)而言，當(dāng)菌液的濃度稀釋到106倍時(shí)，就無(wú)法檢測(cè)到金葡菌。如圖2所示即為L(zhǎng)AMP和PCR檢測(cè)食品中金葡菌檢出限比較示意圖。

圖2 LAMP和PCR檢測(cè)食品中金葡菌檢出限比較示意圖

根據(jù)上述結(jié)果，可以得出LAMP反應(yīng)檢出限是PCR反應(yīng)的100倍。

3 討論

為了進(jìn)一步驗(yàn)證等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的應(yīng)用效果，本試驗(yàn)分別采用LAMP方法和PCR方法檢測(cè)了200份的食品樣品。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用LAMP方法檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌，僅僅需要60分鐘即可，其中30分鐘用于提取金葡菌 DNA，20分鐘用于擴(kuò)增，因此檢測(cè)速度十分迅速，在食品安全監(jiān)督管理中的可行性更高[3]。

將LAMP方法和PCR方法進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，LAMP 方法在對(duì)金葡菌 DNA進(jìn)行提取時(shí)，沒(méi)有十分嚴(yán)格的要求，相關(guān)的抑制因素也較少，尤其是對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)更為容易，可以用肉眼直接觀察是否生成沉淀，從而把握靶序列擴(kuò)增與否。使用LAMP方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌不需要使用電泳與紫外進(jìn)行觀察，檢測(cè)步驟方便簡(jiǎn)潔、檢測(cè)精度更高，因此十分適用于技術(shù)、資金較為薄弱的基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)，同時(shí)LAMP方法在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中也具有較高的優(yōu)勢(shì)，值得推廣應(yīng)用。

[1]徐義剛,李蘇龍,李丹丹,等.食品中金黃色葡萄球菌DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(8).

[2]朱水榮,丁水軍.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增PCR技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌毒素基因的研究[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜誌,2010(20).

[3]唐夢(mèng)君,周生,葛慶聯(lián),等.應(yīng)用LAMP快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2011(27).