香煙煙霧提取物對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的影響

香煙煙霧提取物對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的影響

彭艷胡瑞成1

(長沙市第一醫(yī)院呼吸科，湖南長沙410000)

摘要〔〕目的探討香煙煙霧提取物(CSE)對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1蛋白及其mRNA表達的影響。方法體外培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細胞(A549)，加入10%濃度的CES作用于細胞0、3、6、12、24、48 h，采用免疫蛋白印跡(WB)檢測Derlin-1蛋白表達水平的變化，并運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Derlin-1 mRNA含量的變化。結(jié)果10%濃度的CSE作用下，Derlin-1蛋白的表達逐漸提高，并在6 h達最高，隨后逐漸下降，Derlin-1 mRNA含量變化與Derlin-1蛋白表達一致。結(jié)論香煙煙霧可影響Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的變化，可能與Derlin-1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導凋亡的抑制劑有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕香煙煙霧提取物；Ⅱ型肺泡上皮細胞；Derlin-1； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

中圖分類號〔〕R3〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81070035)；湖南省科技計劃項目(No.2009JT3054)；湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(No.B2008-026)

通訊作者：胡瑞成(1973-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

Effect of cigarette smoke extract on the expressional levels of Derlin-1 in alveolar type Ⅱ cells

PENG Yan, HU Rui-Cheng.

Department of Respiratory,the First Hospital of Changsha City,Changsha 410000,Hunan,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of cigarette smoke extract(CSE) on expressional levels of Derlin-1 protein and mRNA in the cultured A549 cells those were rat alveolar typeⅡ cells lines. MethodsWestern blot was used to detect the level of Derlin-1 protein expression exposured to 10% concentration of CSE at different time (0,3,6,12,24,48 h). RT-PCR was used to measure the change of Derlin-1 mRNA. ResultsIn 10% concentration of CSE, Derlin-1 protein expression gradually was increased and reached the highest at 6 h and then decreased gradually. RT-PCR results consistented with the result of Western blot. ConclusionsCigarette smoke can affect the changes of the expression of Derlin-1 in alveolar typeⅡ cells, which may be associated with that Derlin-1 is the apoptosis inhibitor of endoplasmic reticulum stress.

【Key words】Cigarette smoke extract; Alveolar epithelial cells; Derlin-1; Endoplasmic reticulum stress

1湖南省老年醫(yī)院-湖南省老年醫(yī)學研究所呼吸疾病研究室

第一作者：彭艷(1984-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

吸煙是引起慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要的危險因素之一。近年來研究表明香煙煙霧中的氧化物質(zhì)可導致肺結(jié)構(gòu)細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，加速肺組織損傷和肺功能減退，從而促進COPD的發(fā)生發(fā)展〔1，2〕。Derlin-1也稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白1，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解有密切關(guān)系〔3，4〕。Derlin-1具有緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。但是，目前對Derlin-1在COPD中的作用缺乏研究。Ⅱ型肺泡上皮細胞功能狀態(tài)是決定肺損傷病理轉(zhuǎn)歸的主要因素，在COPD發(fā)病中起重要作用〔5〕。本研究探討香煙煙霧提取物(CSE)對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器A549細胞(本實驗室保存)，芙蓉牌香煙(湖南中煙工業(yè)有限責任公司，尼古丁1.0 mg/支，焦油12 mg/支)；胎牛血清、DMEM購自Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol Reagent、Derlin-1和β-actin引物均來自Invitrogen公司；PCR試劑盒(PCR Master Mix)購于Fermentas公司；DNA Marker 2000購自TaKaRa；總蛋白提取試劑盒(強裂解液和蛋白酶抑制劑)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物研究所；抗Derlin-1抗體(SANTA公司)，β-actin(武漢博士德)；辣根過氧化物酶標記的二抗(抗兔IgG與抗鼠IgG 北京中杉公司)；ECL底物發(fā)光試劑盒購自Thermo公司；低溫高速離心機為美國Beckman公司；普通PCR擴增儀為ABI9600；水平電泳儀(北京六一儀器公司)；紫外分光光度計(上海江儀)；凝膠成像分析系統(tǒng)為中國北京天能，TannonGis-2010型；垂直電泳儀為BIO-RAO公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1CSE的制備參照文獻〔6〕的方法，取兩支去過濾嘴香煙，通過改造的20 ml注射器抽把煙霧抽入50 ml不含血清的DMEM中，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH為7.4，用0.22 μm孔徑的孔濾膜過濾，所得溶液在30 min內(nèi)用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞培養(yǎng)A549細胞在含10%胎牛血清(10%FBS)、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中傳代至第3代在6孔板中調(diào)整細胞密度至4×105～5×105，用無血清DMEM漂洗2次后，加入10%濃度的CSE進行刺激，分別培養(yǎng)0，3，6，12，24，48 h，收集細胞用于后續(xù)Western印跡法和PCR檢測。

1.2.3Western印跡檢測各組細胞中Derlin-1蛋白的表達收集細胞，加入適量預(yù)冷的蛋白裂解液，冰上裂解細胞，Bradford法檢測所提蛋白濃度，取30 μg總蛋白樣品液上樣，進行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，用Derlin-1 (1∶200)、β-actin (1∶1 000)、辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶2 000)，最后用ECL將我發(fā)光試劑顯色，掃描膠片并用Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件分析條帶的灰度值，重復實驗3次。

1.2.4 RT-PCR檢測各組細胞Derlin-1 mRNA的表達收集各組細胞約106～107按說明書加1 ml Trizol試劑裂解細胞，再用氯仿抽提，異丙醇和75%乙醇洗滌沉淀，用無Rnase的雙蒸水溶解RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度；以所提RNA為模板按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成互補脫氧核糖核酸(cDNA),以cDNA作為模板進行聚合酶鏈式反應(yīng)；Derlin-1上游引物：5′-GCTCATTGGAAACCTTGTCG -3′，下游引物：5′- CCACCTCCGCCATTCTGAT -3′，擴增產(chǎn)物為：195 bp，退火溫度：55℃；β-actin 上游引物：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGT-3′，下游引物：5′-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3′,擴增產(chǎn)物為295 bp，退火溫度：61.5℃。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s，反應(yīng)完成后72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物10 μl經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描后，Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件分析擴增產(chǎn)物條帶，分別測定各擴增帶吸光度值，將目的基因與內(nèi)參照β-actin擴增帶的吸光度比值作為其mRNA相對表達水平，重復實驗3次。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2結(jié)果

2.1各組細胞中Derlin-1蛋白的表達大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞在10%濃度CES刺激下，Derlin-1蛋白表達先增高后降低，6 h表達最高(P<0.05)，見表1、圖1。

組別Derlin-1蛋白Derlin-1mRNA0h組12.34±0.692.20±0.103h組15.41±1.181)4.07±0.151)6h組22.26±3.021)2)6.13±0.811)2)12h組18.90±1.581)2)3)3.83±0.211)3)24h組16.95±1.361)3)3.63±0.311)3)48h組14.66±2.373)4)3.10±0.101)2)3)4)F/P值16.82/0.0037.11/0.00

與0 h比較：1)P<0.05；與3 h比較：2)P<0.05；與6 h比較：3)P<0.05；與12 h比較：4)P<0.05

圖1　10%CSE對A549細胞中Derlin-1蛋白表達的影響

2.2Derlin-1 mRNA在各組細胞中的表達用濃度10%的CSE刺激Ⅱ型肺泡上皮細胞，Derlin-1 mRNA先增高后降低，6 h達最高(P<0.05)，見表1，圖2。

圖2　10%CSE濃度對A549細胞中Derlin-1 mRNA表達的影響

3討論

Derlin-1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白，主要分布于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，由4個跨膜區(qū)域組成，其氨基端與羧基端均存在于胞液中〔7～9〕。錯誤折疊或者未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。持續(xù)或者嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)錯誤折疊蛋白通過Derlin-1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中跨膜轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中，隨后被蛋白酶體所降解，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激〔10〕。因此Derlin-1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導凋亡的抑制劑，介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解〔11，12〕。香煙煙霧中的有害成分可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激〔13〕。本研究表明在10%CSE作用下，Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1蛋白的表達先增高后降低，6 h達最高，在時間上有一定的依賴性。本實驗室前期研究表明，香煙煙霧可導致大鼠COPD，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有直接的關(guān)系〔14〕。因此，Derlin-1可能參與香煙煙霧導致COPD的發(fā)病過程中，然而其具體的機制還有待進一步研究。

4參考文獻

1Malhotra D,Thimmulappa R,Vij N,etal.Heightened endoplasmic reticulum stress in the lungs of patients with chronic obstructive pulmonary disease:the role of Nrf2-regulated proteasomal activity〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2009;180(12):1196-207.

2Park JW,Ryter SW,Choi AM.Functional significance of apoptosis in chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.COPD，2007;4(4):347-53.

3Schaheen B，Dang H，F(xiàn)ares H.Derlin-dependent accumulation of integral membrane proteins at cell surfaces〔J〕.J Cell Sci，2009;122(pt 13):2228-39.

4Mori A,Yamashita S，Uchino K,etal.Derlin-1 overexpression ameliorates mutant SOD1-induced endoplasmic reticulum stress by reducing mutant SOD1 accumulation〔J〕.Neurochem Int，2011；58(3)：344-53.

5Tollefson AK，Oberley-Deegan RE，Butterfield KT,etal.Endogenous enzymes(NOX and ECSOD) regulate smoke-induced oxidative stress〔J〕. Free Radic Biol Med,2010；49:1937-46.

6Carp H，Janoff A.Possible mechanisms of emphysema in smokers.In vitro suppression of serum elastase-inhibitory capacity by fresh cigarette smoke and its prevention by antioxidants〔J〕.Am Rev Respir Dis,1978；118:617-21.

7Ye Y，Shibata Y，Yun C,etal.A membrane protein complex mediates retro-translocation from the ER lumen into the cytosol〔J〕.Nature，2004;429(6994):841-7.

8Lilley BN，Ploegh HL.A membrane protein required for dislocation of misfolded proteins from the ER〔J〕.Nature，2004;429(6994):834-40.

9Greenblatt EJ，Olzmann JA，Kopito RR.Derlin-1 is a rhomboid pseudoprotease required for the dislocation of mutant α-1 antitrypsin from the endoplasmic reticulum〔J〕.Nat Struct Mol Biol，2011;18(10):1147-52.

10Sun F，Zhang R，Gong X,etal.Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants〔J〕.J Biol Chem，2006;281(48):36856-63.

11Wang J，Hua H，Ran Y,etal.Derlin-1 is overexpressed in human breast carcinoma and protects cancer cells from endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis〔J〕.Breast Cancer Res，2008;10(1):R7.

12Klopfleisch R，Klose P，Gruber AD.The combined expression pattern of BMP2,LTBP4,and DERL1 discriminates malignant from benign canine mammary tumors〔J〕.Vet Pathol，2010;47(3):446-54.

13甘桂香，胡瑞成，戴愛國.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與慢性阻塞性肺疾病〔J〕.國際呼吸雜志，2010；30：551-4.

14Gan G，Hu R，Dai A,etal.The role of endoplasmic reticulum stress in emphysema results from cigarette smoke exposure〔J〕.Cell Physiol Biochem，2011;28(4):725-32.

〔2012-12-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)