下調(diào)E2-EPF水平對宮頸癌Caski細胞生物學(xué)行為的影響

梁靜，李琳，吳麗杰，凌斌，孫靄萍

（中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100029）

泛素化是一個具有普遍意義的免疫生物學(xué)現(xiàn)象，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化降解是蛋白質(zhì)重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式之一，泛素-蛋白酶體途徑參與調(diào)節(jié)細胞周期進程、細胞增生與分化，以及信號傳導(dǎo)等多種細胞生理過程［1］。泛素系統(tǒng)的紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

泛素結(jié)合酶E2-EPF（ubiquitin-conjugating enzyme E2-EPF）是E2泛素結(jié)合酶家族成員之一，在多種腫瘤組織中高表達［2-3］，無論是在常氧還是低氧情況下，都可以抑制抑癌基因von Hippel-Lindau［4］，穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α），啟動HIF-1α下游反應(yīng)鏈，從而促進腫瘤的生長和侵襲［5-7］。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，E2-EPF 在宮頸癌組織中呈高表達狀態(tài)，其表達水平與臨床分期和病理分級密切相關(guān)，并參與腫瘤細胞的增殖、侵襲等［8］。但有文獻報道，在不同的宮頸癌細胞株中E2-EPF 的作用存在差異［9-10］。因此，我們再次通過siRNA 下調(diào)Caski細胞株中E2-EPF 的表達，研究其在細胞周期、細胞增殖以及放、化療反應(yīng)等方面的影響，探討E2-EPF在宮頸癌中的作用。

資料和方法

一、材料

1.試劑：E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒、對照質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑盒、羊抗兔多克隆抗體（Santa Cruz，美國）；Isogen試劑（Nippon Gene，日本）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、E2-EPF探針、GAPDH 探 針 及PCR 反 應(yīng) 試 劑（Applied Biosystems，美 國）；M-PER 蛋 白 提 取 劑 及BCA 蛋白定量試劑盒（Pierce，美國）；蛋白酶抑制劑（Roche，美國）；E2-EPF C-term 抗體及β-actin抗體（ABGENT，美國）；RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM低血清培養(yǎng)基（Gibco，美國）；MTT 細胞增殖實驗試劑盒（Promega，美國）；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒（武漢華美生物）。

2.細胞系來源及培養(yǎng)：人類宮頸癌細胞Caski（日本東京醫(yī)科大學(xué)），培養(yǎng)于含有10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2。

二、實驗方法

1.細胞轉(zhuǎn)染：收集對數(shù)期生長期的Caski細胞，按3×105／孔種于6 孔板中，培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2。24h后，取100μl E2-EPF-siRNA（siRNA 組）和對照質(zhì)粒（對照組），按說明分別進行瞬時轉(zhuǎn)染。

2.實時熒光定量PCR：按說明提取兩組細胞總RNA，以 波 長A260／280 進 行 定 量。取1 μg 總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄。E2-EPF 探針上游序列為：5’-C GACCTCCAGGTCACCAT-3’；下游序列為：5 ’-GGAACAGACCTCCAGCATATGG-3 ’。 以GAPDH作為內(nèi)參，于StepOnePlus Real-time PCR system 中進行擴增，擴增條件是：95℃10min；95℃15s，50℃10s，60℃1min，40個循環(huán)。以StepOne software v2.0進行定量分析。

3.Western blot：將M-PER 蛋白提取液和蛋白酶抑制劑按50ml∶1片的比例制成混合液加于兩組細胞沉淀中，于冰上裂解30min后，14 800 g 離心15min，取上清，BCA 試劑盒進行蛋白定量。兩組細胞分別提取30μg總蛋白，進行SDS-PAGE 電泳，一抗E2-EPF C-term濃度1∶250，4℃搖床孵育過夜，二抗?jié)舛?∶500，室溫搖床孵育30min。以β-actin為內(nèi)參。

4.細胞周期檢測：將兩組細胞消化分離成單細胞懸液，離心收集細胞，以70%乙醇固定過夜。4ml PBS 洗 滌 細 胞 兩 次，加 入 含 有100 μg／ml RNase A 的100μg／ml碘化丙啶染液，孵育30min。流式細胞儀分析細胞周期。

5.細胞增殖實驗：將1×103Caski細胞接種于96孔板，6h后分別轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)1～9d后，按說明進行MTT 實驗，于酶標儀上測量570nm OD 值。每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

6.放療后細胞死亡與凋亡檢測：取3×105的Caski細胞種于6孔板中，6h后分別轉(zhuǎn)染E2-EPFsiRNA 質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，于37℃，5%CO2培養(yǎng)24h后，將兩組細胞分別經(jīng)0Gy、4Gy、7Gy、10Gy 4個不同劑量X 線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h 和96h。取2×105細胞，PBS洗滌，400μl結(jié)合緩沖液懸浮后，加入5μl Annexin V-FITC，室溫避光10 min，再加入5μl碘化丙啶，流式細胞儀檢測細胞死亡和凋亡比例。每組設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

7.化療藥物實驗：取2×104Caski細胞種于96孔板中，6h后分別轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。加入不同濃度的順鉑（Cisplatin，5μmol／L、20μmol／L、40μmol／L），或紫杉醇（Taxol，10nmol／L、20nmol／L、50nmol／L），或 拓 撲 替 康（Topotecan，0.5nmol／L、1nmol／L、2nmol／L），或 依 托 鉑 苷（Etoposide，0.5 μg／ml、5μg／ml、15μg／ml），24h后進行MTT 檢測細胞相對數(shù)量。細胞存活率以加藥組OD／未加藥組OD×100%表示。不同藥物劑量的兩組細胞均行3復(fù)孔，重復(fù)3次實驗，取平均值。

三、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、siRNA 下調(diào)Caski細胞內(nèi)E2-EPF水平

通過RNAi 技術(shù)下調(diào)Caski 細胞內(nèi)源性E2-EPF水平，并分別通過Real-time PCR 和Western blot在mRNA 和蛋白水平上進行驗證（圖1）。

二、流式細胞周期檢測及細胞增殖實驗

下調(diào)E2-EPF水平后，細胞內(nèi)G0-G1期細胞百分比顯著增加；S和G2-M 期細胞總數(shù)比例減少（圖2）；細胞的生長速率明顯低于對照組，再次證實了E2-EPF參與Caski細胞生長的調(diào)節(jié)（圖3）。

圖1 Caski細胞株轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA 質(zhì)粒后內(nèi)源性E2-EPF的表達情況

圖2 Caski細胞株轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA質(zhì)粒后細胞周期檢測

圖3 Caski細胞株轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA質(zhì)粒后細胞增殖MTT 實驗

三、X 線放療實驗

經(jīng)不同劑量（0Gy、4Gy、7Gy、10Gy）X 線照射后，未發(fā)現(xiàn)下調(diào)細胞內(nèi)源性E2-EPF 對細胞死亡及凋亡的影響。兩組細胞經(jīng)照射后24h，細胞死亡與凋亡檢測結(jié)果如圖4。照射后48h及96h，兩組間細胞死亡與凋亡也無明顯差異（數(shù)據(jù)未顯示）。

四、化療藥物實驗

下調(diào)Caski細胞內(nèi)源性E2-EPF水平對紫杉醇和順鉑的反應(yīng)無明顯作用，但能增強對Topotecan-拓撲異構(gòu)酶I抑制劑和Etoposide-拓撲異構(gòu)酶II抑制劑的敏感性（圖5）。

圖4 不同劑量放療處理24h對于轉(zhuǎn)染E2-EPF-siRNA質(zhì)粒Caski細胞株的影響

圖5 不同濃度Topotecan和Etoposide作用24h對兩組細胞活率的影響

討 論

近年陸續(xù)有報道，E2-EPF 在乳腺癌和食道癌組織中也參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但是對宮頸癌Hela細胞的生長作用結(jié)果不一［9-10］。前期研究已經(jīng)證實E2-2PF 在宮頸鱗癌組織中呈高表達水平，其表達水平與臨床分期和病理分級密切相關(guān)，為了進一步研究E2-EPF 在不同宮頸癌細胞株中的作用，本文再次針對Caski進行研究。利用RNAi瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，下調(diào)Caski細胞株內(nèi)E2-EPF水平，可以調(diào)控細胞的生長周期，減緩細胞的生長速度。由此可見，E2-EPF參與Caski細胞周期的調(diào)控及細胞的增殖，對于腫瘤細胞的生長有重要的意義。

Topotecan作為拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的抑制劑可以與拓撲異構(gòu)酶I-DNA 三元復(fù)合物結(jié)合，從而阻礙斷裂DNA 單鏈的重新連接，并影響拓撲異構(gòu)酶I的再循環(huán)利用，使哺乳動物細胞無法有效地修復(fù)損傷的DNA 雙鏈，最終導(dǎo)致細胞死亡［11-13］。細胞毒性作用主要作用于DNA 合成的S期，同樣也作用于DNA損傷后的修復(fù)和基因表達過程［13］。由于拓撲異構(gòu)酶I的濃度在增生期細胞中隨整個細胞周期保持穩(wěn)定，在靜止期細胞中此酶也有表達，因此對增殖緩慢及耐藥的實體瘤均有潛在作用［14］。本實驗中，在0.5nmol／L、1nmol／L 和2nmol／L 三 個 濃 度 的Topotecan作用下，siRNA 組與對照組間均有顯著差異。

Etoposide作用于DNA-拓撲異構(gòu)酶II，形成藥物-酶-DNA 復(fù)合物，阻礙DNA 修復(fù)造成DNA 鏈斷裂，作用于哺乳動物細胞周期的G2期［15］。高濃度（≥10μg／ml）時，Etoposide使進入有絲分裂期的細胞溶解，而低濃度（0.3～10μg／ml）時，則抑制細胞進入有絲分裂的前期。本實驗中，在0.5μg／ml、5 μg／ml和15μg／ml三個不同濃度下，下調(diào)E2-EPF使細胞對Etoposide的敏感性均顯著增加，這一結(jié)果與其藥理特性相吻合。

結(jié)合前期研究結(jié)果［8］，在宮頸鱗狀細胞癌中，E2-EPF參與細胞周期的調(diào)控與細胞增殖，對腫瘤的生長有重要意義。下調(diào)細胞內(nèi)源性E2-EPF，可以使HIF-1α蛋白水平下降，明顯減弱細胞的增殖、侵襲和體外成瘤性，并可以增強細胞對拓撲異構(gòu)酶I抑制劑和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑的敏感性。

【致謝】 本實驗部分于日本東京醫(yī)科大學(xué)產(chǎn)婦人科實驗室完成，特別感謝井本惠一教授、西洋孝醫(yī)師及樋熊千夏給予的支持及幫助。

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