比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)體外受精胚胎培養(yǎng)對臨床結(jié)果的影響

張歡，鄭屹，王海青，周穎，周瑋，吳永根，黃學(xué)鋒

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖中心，溫州 325000）

在輔助生殖中，移植胚胎的發(fā)育潛能是影響臨床結(jié)果的重要因素［1］。因此，在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）過程中合理選擇高發(fā)育潛能的胚胎至關(guān)重要。目前胚胎評價主要基于胚胎的發(fā)育速度，以及胚胎的形態(tài)學(xué)。雖然各個輔助生殖中心的胚胎形態(tài)學(xué)評價標準有所差異，但評價卵裂期胚胎的指標主要還是碎片程度、卵裂球的數(shù)目、均一度、形態(tài)、對稱性等指標［2-4］。而囊胚期則主要評估囊腔大小、內(nèi)細胞和滋養(yǎng)層細胞的多少［5］。這些指標能大致反映胚胎體外發(fā)育是否正常以及植入后發(fā)育潛能的大小。然而，一些研究［6-7］發(fā)現(xiàn)胚胎形態(tài)學(xué)評分結(jié)合特定時間點胚胎發(fā)生事件可以提高胚胎的種植率。因此，一些學(xué)者認為盡可能多了解胚胎發(fā)育信息有助于遴選高發(fā)育潛能的胚胎。近年興起的延時攝像胚胎觀測技術(shù)（time-lapse）能自動獲取胚胎發(fā)育各個階段的形態(tài)以及各事件發(fā)生的特定時間，并能夠保證觀察過程中胚胎發(fā)育環(huán)境的穩(wěn)定，提供更多信息進行胚胎挑選移植。本研究旨在分析比較timelapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)對臨床結(jié)果的影響，探討time-lapse培養(yǎng)是否更有利于培育高潛能胚胎。

對象和方法

一、研究對象

選取2013年10月至2015年1月期間在本中心行體外受精／卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（IVF／ICSI-ET）的110 例time-lapse 培 養(yǎng) 周 期 和2 274 例常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)周期的臨床結(jié)果。納入標準：因女方輸卵管因素、男方少弱畸精子癥、梗阻型無精子癥以及其他因素在我中心接受IVF／ICSIET 助孕治療的不孕不育患者。所有入選周期排除了女性子宮因素（如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等）以及其他疾病因素（卵巢儲備功能下降、染色體臂間倒位、多囊卵巢綜合征等）。

所有入選周期受精數(shù)≥6 個，同時由于Primo Vision 胚胎培養(yǎng)皿（Vitrolife，瑞典）最多只能放置16個胚胎，所以所有入選周期受精數(shù)≤16個。實驗中所有患者被隨機分配成time-lapse 組和常規(guī)IVF組。

二、方法

1.超排卵方案：采用標準長方案和短方案進行。

2.精液處理：精液液化后，行IVF 的精液經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心法處理后，在受精液（G-IVF Plus，Vitrolife，瑞典）中上游1h后備用；行ICSI的精液經(jīng)胚胎緩沖液（G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典）直接離心后備用。受精前按照WHO 標準［8］，分別檢測精液量，以及精子濃度和活動率。

3.IVF／ICSI：注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，Merck Serono，德國）36h后經(jīng)陰道B 超引導(dǎo)下取卵，根據(jù)臨床指征行IVF 或ICSI。IVF 授精：分別將精子、卵母細胞加入到受精培養(yǎng)液滴中進行受精。ICSI授精：卵母細胞經(jīng)過透明質(zhì)酸酶（Sigma，美國）剝除顆粒細胞后，轉(zhuǎn)移至G-MOPS Plus 滴中行ICSI。

4.胚胎培養(yǎng)：受精觀察后，常規(guī)組將正常受精胚胎轉(zhuǎn)移至卵裂培養(yǎng)滴（G-1Plus，Vitrolife，瑞典）并置于Thermo Forma培養(yǎng)箱中37°C、6%CO2條件下培養(yǎng)；time-lapse組將正常受精胚胎轉(zhuǎn)移至含卵裂培養(yǎng)滴并置于Thermo Forma培養(yǎng)箱內(nèi)的Primo vision胚胎監(jiān)測儀器（Vitrolife，瑞典）中37 ℃、6%CO2條件下培養(yǎng)。

5.胚胎質(zhì)量評估：常規(guī)組胚胎體外培養(yǎng)至第3天（D3），根據(jù)細胞數(shù)目、卵裂球的形態(tài)、均一度以及碎片進行評分。優(yōu)質(zhì)胚胎評價參照本生殖中心標準［9］。time-lapse組胚胎體外培養(yǎng)至D3，Primo vision分析系統(tǒng)（Vitrolife，瑞典）根據(jù)胚胎發(fā)育過程中每個事件的發(fā)生時間并結(jié)合D3形態(tài)學(xué)對胚胎進行評分。胚胎發(fā)生事件包括：第1 次卵裂時間（＜45min）、2細胞出現(xiàn)時間（20～32h）、2～3細胞的時間（8～12h）、3 細胞出現(xiàn)時間（31～42h）、3～4細胞的時間（＜75 min）、4 細胞出現(xiàn)時間（35～44h）、4～5細胞的時間（13～16h）、5細胞出現(xiàn)時間（49～57h）等。

6.胚胎移植和妊娠檢查：選擇評分最高的2～3枚胚胎進行移植，以移植后4～6周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。均數(shù)比較采用t檢驗，率之間比較采用卡方檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)對受精個數(shù)≤10周期臨床結(jié)果的影響

本研究共110例time-lapse培養(yǎng)周期和2 274 例常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)周期，所有入選周期的受精卵為6～16個，根據(jù)中位數(shù)劃分為受精卵＞10的周期（多胚胎周期）和受精卵≤10的周期（非多胚胎周期）。

其中65例time-lapse培養(yǎng)周期和1 618例常規(guī)IVF培養(yǎng)周期的受精個數(shù)介于6～10個。兩組的基本情況：年齡［（31.5±4.0）歲vs.（31.0±4.2）歲，P＞0.05］、體重指數(shù)（BMI）［（21.1±2.7）kg／m2vs.（21.5±2.9）kg／m2，P＞0.05］、不 育 年 限［（4.0±3.4）年vs.（3.8±2.7）年，P＞0.05］、原發(fā)不育率（32.3% vs.39.9%，P＞0.05）；兩組授精方 式：ICSI（15.4% vs.21.7%）、IVF （80.0% vs.67.9%）、IVF／ICSI（4.6% vs.10.4%），均無顯著性差異（P＞0.05）。

兩組獲卵數(shù)、成熟數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、ET 數(shù)、以及種植率和臨床妊娠率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

二、比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)對受精數(shù)＞10周期臨床結(jié)果的影響

共45個time-lapse培養(yǎng)周期和656 個常規(guī)培養(yǎng)周期的受精個數(shù)介于11～16。兩組的基本情況：年齡［（31.6±4.2）歲vs.（30.5±4.0）歲，P ＞0.05］、BMI［（21.0±2.5）kg／m2vs.（21.6±3.0）kg／m2，P＞0.05］、不 育年限［（3.9±3.3）年vs.（3.9±2.8）年，P＞0.05］、原發(fā)不育率（26.7%vs.39.6%，P＞0.05）；兩組授精方式：ICSI（28.9%vs.18.9%），IVF （64.4% vs.70.7%），IVF／ICSI（6.7%vs.10.4%），均無顯著性差異（P＞0.05）。

兩組之間獲卵數(shù)、成熟數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、ET 數(shù)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但time-lapse培養(yǎng)周期的種植率和臨床妊娠率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)周期（P＜0.05）（表2）。

表1 受精數(shù)≤10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

表1 受精數(shù)≤10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

注：兩組比較，P 均＞0.05

組 別 周期數(shù)（個） 獲卵數(shù)（個） 成熟數(shù)（個） 受精數(shù)（個） 卵裂數(shù)（個）time-lapse培養(yǎng)周期65 11.8±3.2 10.5±2.7 7.8±1.3 7.5±1.3常規(guī)培養(yǎng)周期 1 618 12.1±3.4 10.6±2.7 7.8±1.4 7.6±1.5組 別 D3優(yōu)胚數(shù)（個） D3優(yōu)胚率 ET 數(shù)（個） 種植率 妊娠率time-lapse培養(yǎng)周期2.9±2.1 37.3 2.4±0.5 30.1 47.7常規(guī)培養(yǎng)周期2.6±1.9 34.3 2.3±0.4 35.4 55.5

表2 受精數(shù)＞10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

表2 受精數(shù)＞10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

注：與timp-lapse培養(yǎng)周期比較，＊P＜0.05

組 別 周期數(shù)（個） 獲卵數(shù)（個） 成熟數(shù)（個） 受精數(shù)（個） 卵裂數(shù)（個）time-lapse培養(yǎng)周期45 17.1±2.9 15.6±2.7 13.0±1.9 12.2±2.6常規(guī)培養(yǎng)周期 656 17.4±3.6 15.9±3.0 12.6±1.6 12.2±1.8組 別 D3優(yōu)胚數(shù)（個） D3優(yōu)質(zhì)胚胎率 ET 數(shù)（個） 種植率 妊娠率time-lapse培養(yǎng)周期4.5±2.7 37.0 2.1±0.3 56.8 77.8常規(guī)培養(yǎng)周期 4.3±4.2 35.6 2.1±0.3 40.0＊ 57.5＊

討 論

本研究回顧性分析了2013年10月至2015年1月期間在本中心行IVF／ICSI-ET 的110例timelapse培養(yǎng)周期和2 274 例常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)周期的臨床結(jié)果。我們分別比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)對受精數(shù)≤10或＞10周期臨床結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)當受精數(shù)≤10 時，time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期的種植率、臨床妊娠率無顯著性差異，而當受精數(shù)＞10時，time-lapse周期的種植率（56.8% vs.40.0%）和 臨 床 妊 娠 率（77.8%vs.57.5%）均顯著高于常規(guī)培養(yǎng)周期（P＜0.05）。

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，time-lapse儀器作為一種新的設(shè)備開始在各個臨床中心運用。Timelapse可以在保持胚胎培養(yǎng)條件穩(wěn)定的情況下，通過每天24h連續(xù)非侵入性的胚胎觀察，捕捉胚胎發(fā)育過程中形態(tài)學(xué)的動態(tài)變化并進行攝影成像［10-12］。最后通過軟件對胚胎各個發(fā)生事件的時間進行標記、記錄卵裂異常等行為，進行分析后挑選胚胎移植。雖然time-lapse技術(shù)中平均每個胚胎需要在LED 光線下暴露約300次／d，但實際上總暴露時間小于50s／d，在過去的5～6年里，大量的研究已經(jīng)確認了time-lapse技術(shù)的安全性［13-14］。現(xiàn)今，各個中心主要使用Primo vision、Embryoscope、EEVA三種time-lapse監(jiān)測系統(tǒng)［15］。本研究采用Primo vision監(jiān)測系統(tǒng)，可以監(jiān)測掃描11 個聚焦平面，最短可保持每5min進行一次圖片記錄，這非常有利于準確捕捉胚胎一些動態(tài)變化（比如，原核消失到2細胞的時間為30～35min）。

至今，尚無足夠的研究證實運用time-lapse培養(yǎng)相比常規(guī)培養(yǎng)有可以獲得更高的臨床妊娠率和出生率。Siristatidis等［16］采用time-lapse培養(yǎng)技術(shù)獲得了比常規(guī)培養(yǎng)更高的臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率和出生率，尤其當女性年齡＞40歲時，顯著性更加明顯。Azzarello等［17］運用time-lapse觀察原核形態(tài)、記錄原核消失時間，發(fā)現(xiàn)原核消失時間遲于20h45 min 的胚胎其種植率顯著高于原核消失早于20h 45min 的胚胎。而Cruz等［14］則比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的胚胎質(zhì)量、囊胚形成率、臨床妊娠率等指標，發(fā)現(xiàn)兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。Lemmen等［18］使用time-lapse系統(tǒng)培養(yǎng)102枚正常受精卵，發(fā)現(xiàn)D2時58%的胚胎到達4細胞階段，82%的胚胎可用于移植或冷凍，這同常規(guī)培養(yǎng)相比無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究中，當受精數(shù)≤10時，time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的臨床結(jié)局無統(tǒng)計學(xué)差異，但當受精數(shù)＞10時，time-lapse培養(yǎng)的臨床妊娠率、種植率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)。我們分析認為：當受精數(shù)≤10 個時，time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)分別為（2.9±2.1）個和（2.6±1.9）個，根據(jù)臨床指征通常胚胎移植時需2～3枚胚胎，常規(guī)培養(yǎng)周期通過D3形態(tài)學(xué)評分可以選擇出僅有的2～3枚優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，而time-lapse培養(yǎng)周期運用D3形態(tài)學(xué)評分結(jié)合早期胚胎發(fā)生事件時，由于優(yōu)質(zhì)胚胎往往卵裂時間和行為異常率遠遠低于低質(zhì)量胚胎，而且形態(tài)學(xué)本身就是個重要參考，因而timelapse挑選的優(yōu)勢不是很明顯；而當受精數(shù)＞10時，time-lapse和常規(guī)培養(yǎng)周期的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)分別為（4.5±2.7）個和（4.3±4.2）個，形態(tài)學(xué)評分無法很好選擇最優(yōu)2～3枚胚胎進行移植，此時運用timelapse技術(shù)結(jié)合胚胎早期發(fā)生事件，可以避免移植那些D3形態(tài)學(xué)評分優(yōu)級但早期出現(xiàn)卵裂行為異常、卵裂時間異常以及出現(xiàn)多核細胞的胚胎。

此外，有研究［19］認為time-lapse培養(yǎng)相對普通培養(yǎng)可以避免培養(yǎng)箱頻繁的開關(guān)，保持培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境尤其是pH 和溫度的穩(wěn)定，有利于獲得高質(zhì)量的胚胎。但本研究中，無論受精數(shù)≤10或者＞10的周期，time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率均無統(tǒng)計學(xué)差異。因此，我們認為受精數(shù)＞10的time-lapse培養(yǎng)周期相對于常規(guī)培養(yǎng)周期的高種植率和高臨床妊娠率主要是通過優(yōu)選高發(fā)育潛能胚胎進行移植而非提高胚胎質(zhì)量方式完成的。目前time-lapse挑選時參考的早期事件主要包括卵裂細胞出現(xiàn)的時間和維持時間以及卵裂異常和多核等異常行為。本研究主要采用1～5卵裂球細胞出現(xiàn)的時間和維持時間以及是否出現(xiàn)多核、卵裂異常等參數(shù)來判斷胚胎的發(fā)育潛能。這些參數(shù)在常規(guī)培養(yǎng)周期中無法觀察到，但在很多研究中證實是有利于胚胎篩選的。Meseguer等［20］分析認為，5細胞出現(xiàn)時間、3～4 細胞的時間、2 細胞出現(xiàn)的時間，以及2～3細胞的時間有助于篩選高種植率的胚胎。Basile等［21］通過研究多中心的time-lapse數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)3細胞出現(xiàn)時間、5細胞出現(xiàn)時間、2～3細胞的時間與胚胎種植存在相關(guān)性，而多核、異常卵裂的胚胎發(fā)育潛能不高。

本研究證實，受精數(shù)＞10 的周期通過timelapse培養(yǎng)可以獲得比常規(guī)培養(yǎng)周期更高的臨床妊娠率和種植率。當然本研究的樣本量比較少，同時僅僅以胚胎種植、臨床妊娠作為統(tǒng)計結(jié)局。下一步，我們考慮擴大樣本量，并增加囊胚形成、出生率等指標證實本結(jié)論。

［1］ Edwards RG，F(xiàn)ishel SB，Cohen J，et al.Factors influencing the success of in vitro fertilization for alleviating human infertility［J］.J In Vitro Fert Embryo Transf，1984，1：3-23.

［2］ Hardarson T，Hanson C，Sjogren A，et al.Human embryos with unevenly sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates： indications for aneuploidy and multinucleation［J］.Hum Reprod，2001，16：313-318.

［3］ Pickering SJ，Taylor A，Johnson MH，et al.An analysis of multinucleated blastomere formation in human embryos［J］.Hum Reprod，1995，10：1912-1922.

［4］ Racowsky C，Vernon M，Mayer J，et al.Standardization of grading embryo morphology［J］.J Assist Reprod Genet，2010，27：437-439.

［5］ Gardner DK，Surrey E，Minjarez D，et al.Single blastocyst transfer：a prospective randomized trial［J］.Fertil Steril，2004，81：551-555.

［6］ Nagy ZP，Dozortsev D，Diamond M，et al.Pronuclear morphology evaluation with subsequent evaluation of embryo morphology significantly increases implantation rates［J］.Fertil Steril，2003，80：67-74.

［7］ Finn A，Scott L，O’Leary T，et al.Sequential embryo scoring as a predictor of aneuploidy in poor-prognosis patients［J／OL］.Reprod Biomed Online，2010，21：381-390.

［8］ 世界衛(wèi)生組織.WHO 人類精液及精子一宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊［S］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：11-33.

［9］ 鄭屹，張歡，林佳，等.兩側(cè)卵巢獲卵數(shù)差異率與體外受精-胚胎移植結(jié)局的關(guān)系［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2015，24：26-31.

［10］ Payne D，F(xiàn)laherty SP，Barry MF，et al.Preliminary observations on polar body extrusion and pronuclear formation in human oocytes using time-lapse video cinematography［J］.Hum Reprod，1997；12：532-541.

［11］ Scott L.Pronuclear scoring as a predictor of embryo development［J／OL］.Reprod Biomed Online，2003，6：201-214.

［12］ Kirkegaard K，Agerholm IE，Ingerslev HJ.Time-lapse monitoring as a tool for clinical embryo assessment［J］.Hum Reprod，2012，27：1277-1285.

［13］ Nakahara T，Iwase A，Goto M，et al.Evaluation of the safety of time-lapse observations for human embryos［J］.J Assist Reprod Genet，2010，27：93-96.

［14］ Cruz M，Gadea B，Garrido N，et al.Embryo quality，blastocyst and ongoing pregnancy rates in oocyte donation patients whose embryos were monitored by time-lapse imaging［J］.J Assist Reprod Genet，2011，28：569-573.

［15］ Kovacs P.Embryo selection：the role of time-lapse monitoring［J］.Reprod Biol Endocrinol，2014 12：124-134.

［16］ Siristatidis C，Komitopoulou MA，Makris A，et al.Morphokinetic parameters of early embryo development via time lapse monitoring and their effect on embryo selection and ICSI outcomes：a prospective cohort sutdy［J］.J Assist Reprod Genet，2015.［Epub ahead of print］

［17］ Azzarello A，Hoest T，Mikkelsen AL.The impact of pronuclei morphology and dynamicity on live birth outcome after time-lapse culture［J］. Hum Reprod，2012，27：2649-2657.

［18］ Lemmen JG，Agerholm I，Ziebe S.Kinetic markers of human embryo quality using time-lapse recordings of IVF／ICSIfertilized oocytes［J／OL］.Reprod Biomed Online，2008，17：385-391.

［19］ Meseguer M，Rubio I，Cruz M，et al.Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with standard incubator：a retrospective cohort study［J］.Fertil Steril，2012，98：1481-1489.

［20］ Meseguer M，Herrero J，Tejera A，et al.The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation ［J］.Hum Reprod，2011，26：2658-2671.

［21］ Basile N，Vime P，F(xiàn)lorensa M，et al.The use of morphokinetics as a predictor of implantation：a multicentric study to define and validate an algorithm for embryo selection［J］.Hum Reprod，2015，30：276-283.