活性元宮型藥銅宮內(nèi)節(jié)育器銅離子及藥物體外釋放的研究

侯麗，周越，辛玲，高娜娜，杜江，2，邵海浩，吳尚純，王慧萍＊

（1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.上海市計劃生育科學(xué)研究所，上海 200032）

宮內(nèi)節(jié)育器（IUD）是一種相對安全、長效、簡便、經(jīng)濟(jì)、可逆、對性生活以及哺乳無影響的避孕措施，深受廣大育齡婦女的歡迎。為了提高避孕效果，IUD 在材質(zhì)、結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了不斷改進(jìn)，發(fā)展至今，含銅IUD 成為目前國際公認(rèn)的性能較理想的宮內(nèi)節(jié)育器［1］。

含銅IUD 除了惰性支架引起機(jī)械性壓迫和損傷外，銅離子（Cu2＋）釋放引起的生物毒性常會導(dǎo)致盆腔炎、出血和疼痛等不良反應(yīng)，成為影響含銅IUD 續(xù)用率的主要原因［2］。為解決這一問題，我國科研人員研制出以硅橡膠為載體、含吲哚美辛（IMC）的含銅含藥IUD，此類IUD 能夠在提高避孕效果的基礎(chǔ)上，減少Cu2＋的“暴釋現(xiàn)象”所帶來的不良反應(yīng)的發(fā)生。但由于藥物含量、釋放特性、材料設(shè)計和制作方法等不同因素，目前臨床上常用的藥銅IUD 存在著IMC釋放不穩(wěn)定或釋放量少而達(dá)不到預(yù)期效果的問題［3］。所以本課題組對此類產(chǎn)品給予了進(jìn)一步更新，采用理化性質(zhì)更穩(wěn)定、具有更高生物利用度的新型前列腺素合成酶抑制劑雙氯芬酸鈉（DFS），研制成了新型活性元宮型藥銅IUD。

為避免體內(nèi)實驗的局限性，本研究以模擬宮腔液為釋放介質(zhì)，以含IMC 或DFS 的兩種活性元宮型藥銅為研究對象，采用體外模擬釋放的方法檢測Cu2＋濃度，比較IMC和DFS的體外釋放規(guī)律，初步探索Cu2＋與藥物的生物相容性關(guān)系，為改進(jìn)此類節(jié)育器提供可靠的實驗數(shù)據(jù)及途徑。

材料與方法

一、研究材料

1.IUD：元宮藥銅288型IUD（含20mg IMC，Cu 表 面 積288 mm2）和 元 宮 藥 銅288 型IUD（含20mg DFS，Cu表面積288mm2）由上海市計劃生育科學(xué)研究所提供。

2.儀器：電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（thermo 6300serial，Thermo，美國）；紫外／可見分光光度儀（島津UV-2450，日本）；掃描電鏡（島津SS-550／S ERVO，日 本）和 恒 溫 水 浴 振 蕩 器（ZWY-110X30，上海智城）。

3.模擬宮腔液的配制：以模擬宮腔液作為釋放介質(zhì)，模擬宮腔液的成分如下［4］：NaCl 4.97g／L、KCl 0.224g／L、CaCl20.167g／L、NaHCO30.25g／L、葡萄糖0.50g／L、NaH2PO4·2H2O 0.072g／L。由于pH 值對銅的腐蝕很重要［5］，實驗采取1mol／L的HCl溶液以及1mol／L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)模擬宮 腔 液pH 值 為7.0（人 體 宮 腔 液pH6.0～7.9）［6］。

4.標(biāo)準(zhǔn)品配制：Cu2＋儲備液由定量稀釋商品銅標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度：1000mg／L，中國計量科學(xué)研究院）得到。IMC和DFS標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國藥品生物制品檢定所。IMC標(biāo)準(zhǔn)儲備液（150mg／L）和DFS標(biāo)準(zhǔn)儲備液（150mg／L）均用模擬宮腔液配制并稀釋。所有溶液均用去離子溶液配制。

二、實驗方法

1.繪制Cu2＋的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將1 000mg／L 的銅儲備液用1%的稀硝酸逐級稀釋至0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg／L 的系列Cu2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其吸光度值。銅標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝580.420x-3.164，x指吸光度值，y 為Cu2＋濃度。

2.繪制IMC 標(biāo)準(zhǔn)曲線：用模擬宮腔液配制IMC儲備液，并稀釋得到含IMC 0、1、2、4、5、8、10、12、15mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度儀進(jìn)行紫外掃描，確定最大吸收波長，選擇318nm 波長處測定標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。IMC標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝57.80153x-0.14364（R2＝0.99974），x指吸光度值，y為IMC濃度。

3.繪制DFS標(biāo)準(zhǔn)曲線：用模擬宮腔液配制DFS儲備液，并稀釋得到含DFS 0、10、14、16、20、25、30、40、50mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度儀進(jìn)行紫外掃描，確定最大吸收波長，選擇275nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。DFS標(biāo)準(zhǔn) 曲 線 方 程 為y＝31.07521x-0.14445（R2＝0.99994），x指吸光度值，y為DFS濃度。

4.Cu2＋釋放量測定：參考文獻(xiàn)所述［7］，取2種型號元宮藥銅宮內(nèi)節(jié)育器各5 只分別浸入盛有50ml模擬宮腔液的錐形瓶中密封，然后置于（37±1）℃的恒溫水浴振蕩器中保持不同時間，前3d每天換液，隨后的1周每2d換液，隨后20d每4d換液，之后每周換液。收集更換下的液體，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定其吸收值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得Cu2＋濃度。

5.IMC釋放率測定：收集浸泡元宮藥銅宮內(nèi)節(jié)育器（帶20 mg IMC）的液體，在318nm 波長處測定其吸收值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝57.80153x-0.14364（R2＝0.99974），求 得 濃 度 值，計 算IMC含量。

6.DFS的釋放率測定：收集浸泡元宮藥銅宮內(nèi)節(jié)育器（帶20mg DFS）的液體，在275nm 波長處測定其吸收值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝31.07521x-0.14445（R2＝0.99994），求 得 濃 度 值，計 算DFS含量。

7.宮內(nèi)節(jié)育器表面形貌分析：在元宮藥銅宮內(nèi)節(jié)育器未浸泡前以及浸泡10、30、60d 后，取出樣品，用去離子水沖洗干凈，干燥后，用掃描電鏡觀察樣品表面形貌。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、Cu2＋釋放量測定

結(jié)果顯示：在初始階段（前20d），2 種藥銅IUDs的Cu2＋釋放均較快且不平穩(wěn)（Cu2＋的暴釋現(xiàn)象）；前2～9d，元宮藥銅IUD-DFS的Cu2＋每日釋放量均大于元宮藥銅IUD-IMC，且在3～7dCu2＋的每日釋放量有顯著差別（P＜0.05）；10～17d，元宮藥銅IUD-DFS的Cu2＋每日釋放量均小于元宮藥銅IUD-IMC，且在14～17d但兩者之間有顯著性差異（P＜0.05）；第18天后2種藥銅IUDs的釋放量幾乎相同（P＞0.05）（圖1）；兩組IUD的Cu2＋的累計釋放量在前、后期差別不大，差值變化較?。≒＞0.05），但在5～33d有顯著差別（P＜0.05）（圖2）。

二、DFS和IMC的每天釋放量比較

DFS在釋放介質(zhì)中呈現(xiàn)雙相釋放：在前10d，藥物釋放較快，10～20d釋放達(dá)到平衡，20d后基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)，此后DFS 每24h 平均釋放量約為（0.134±0.025）mg（圖3）。而IMC 在模擬宮腔液中的早期釋放則呈不規(guī)則狀態(tài)，前7d的釋放量顯著少于DFS（P＜0.05），8d后每天釋放量又顯著大于DFS（P＜0.05），20d后IMC的24h平均釋放量約為（0.675±0.175）mg（圖3）。

三、DFS和IMC的累計釋放量比較

1～7dIMC的釋放速率較慢，累計釋放量顯著小于DFS（P＜0.05），8d后釋放較快，并在第9d與DFS趨同（P＞0.05），10d后超越了DFS的累計釋放量（P＜0.05）（圖4）。

圖1 元宮藥銅IUDs的Cu2＋每天釋放量（n＝5）

圖2 元宮藥銅IUDs的Cu2＋累計釋放量（n＝5）

圖3 元宮藥銅IUDs的DFS和IMC的每天釋放量（n＝5）

圖4 元宮藥銅IUDs的DFS和IMC的累計釋放量（n＝5）

四、元宮藥銅釋放后銅絲表面的形貌比較

掃描電鏡觀察樣品表面形貌結(jié)果顯示：浸泡前，兩組IUD 銅套表面均基本光滑（圖5A、B），可看到銅絲表面有略微的凹凸不平，存在拉痕，為自然的純銅表面特征（圖5a、b）。浸泡10d后，兩組銅套表面均有較稀疏的淺的蝕坑（圖5C、D），其 中 含IMC 的IUD 銅 絲 表 面 腐 蝕 程 度較重（圖5c）。浸泡30d后，兩組銅套表面有密集的較大的蝕坑（圖5E、F），且兩組銅絲的表面均出現(xiàn)了絮狀沉淀（圖5e、f）。浸泡60d后，兩組銅套表面有大而深的蝕坑（圖5G、H），可以看見蝕坑外和蝕坑內(nèi)還存在很多顆粒，可能是表面沉積物和腐蝕產(chǎn)物，但I(xiàn)MC 組的沉積物更多（圖5g、h）。對比兩組藥銅IUD 浸泡前和浸泡后的銅絲形貌（圖5a和c、e、g，5b和d、f、h），可觀察到隨著浸泡時間的增加，兩組銅絲的腐蝕程度均增加。

圖5 浸入模擬宮腔液不同時間的藥銅IUD 銅絲表面形貌

討 論

由于含銅IUD 引起的經(jīng)血量過多和疼痛主要與Cu2＋暴釋導(dǎo)致的子宮局部前列腺素產(chǎn)生和釋放有關(guān)，中國科研人員研制出含前列腺素合成酶抑制劑IMC和以醫(yī)用高分子材料硅橡膠為載體的緩釋系統(tǒng)，進(jìn)而開發(fā)出具有這種緩釋系統(tǒng)的含銅含藥IUD。臨床資料顯示這類藥銅IUD 的確能有效控制放置IUD 后早期月經(jīng)血量的增多，減輕疼痛，因癥取出率低［8］，給育齡婦女提供了一種很好的避孕選擇，是IUD 的發(fā)展與進(jìn)步。

但某些上市的藥銅宮內(nèi)節(jié)育器由于IMC 釋放、IMC與材料的組織相容性等諸多因素，存在著質(zhì)量不等、標(biāo)準(zhǔn)不一、釋放不穩(wěn)定等問題，直接影響到避孕安全，從而關(guān)系到育齡婦女的身心健康。因此，選擇性質(zhì)穩(wěn)定的前列腺素合成酶抑制劑，研發(fā)安全、有效的新型藥銅IUD 迫在眉睫。

眾所周知，IMC 是一種非選擇性非甾體類抗炎藥，通過抑制環(huán)氧合酶（COX）影響花生四烯酸的代謝，使生理性、炎癥性前列腺素（PG）的合成減少，局部炎癥反應(yīng)、組織的充血腫脹、對緩激肽等的疼痛敏感性都減輕，從而發(fā)揮其抗炎、鎮(zhèn)痛作用，但不可避免的會影響機(jī)體的正常生理功能。研究表明，哺乳動物的COX 至少有2種同工酶COX-1和COX-2，他們催化的反應(yīng)相同，但其產(chǎn)物的表達(dá)、功能和特性有明顯的不同［9］。COX-1是結(jié)構(gòu)酶，在大多數(shù)組織中都有表達(dá)，其催化生成的PGs參與維持機(jī)體的多種生理功能，如保護(hù)胃黏膜細(xì)胞、維持腎血流量、調(diào)節(jié)血小板功能等；COX-2是誘導(dǎo)型酶，多數(shù)組織內(nèi)不表達(dá)，但在多種致炎因子刺激下，能在滑膜細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)［10］，表達(dá)水平可升高10倍～80倍，催化形成過量的病理性PGs，參與炎癥反應(yīng)，誘發(fā)疼痛［11］。因此選擇性COX-2抑制劑比IMC等非選擇性非甾體類抗炎藥更能發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用［12］。

DFS，化學(xué)名稱為2-［（2，6-二氯苯基）氨基］苯乙酸鈉，為苯乙酸類衍生物，是選擇性COX-2抑制劑。本藥的作用機(jī)制是抑制炎癥反應(yīng)中的環(huán)氧合酶，對COX-2的抑制明顯高于對COX-1的抑制，因此它的抗炎、鎮(zhèn)痛作用明顯強于阿司匹林、IMC 等藥物。其特點是劑量小，起效快，不良反應(yīng)少，且耐受性好，個體差異小，長期應(yīng)用無蓄積作用［13］。近年來隨著DFS研究的深入，其臨床適應(yīng)證也越來越多［14-16］。所以本課題對藥銅IUD 給予了改善和更新，采用DFS研制成新型藥銅IUD，與含IMC的藥銅IUD 進(jìn)行對照，比較兩者的Cu2＋和藥物釋放規(guī)律。

由研究結(jié)果可知，兩種藥銅IUD 在浸泡初期均有嚴(yán)重的暴釋現(xiàn)象，且釋放不穩(wěn)定，釋放速率曲線為先上升再下降，反復(fù)幾次，21d后釋放趨于低濃度穩(wěn)定，之后，2種藥銅IUDs的每天釋放速率和累計釋放速率幾乎相同。從而可推斷2 種藥銅IUDs Cu2＋釋放規(guī)律幾乎無差異。

對比兩組藥銅IUD，我們可以看到在浸泡初期，當(dāng)DFS 的釋放速率高時，含DFS 元宮藥銅的Cu2＋的釋放速率比含IMC 元宮藥銅的釋放速率高得多；當(dāng)IMC的釋放速率高時，含IMC 元宮藥銅的Cu2＋的釋放速率并不比含DFS元宮藥銅低，兩者幾乎持平。這說明銅的腐蝕有可能加速了DFS的釋放，Cu2＋的腐蝕速率越快，DFS 的釋放量越大，而DFS的快速釋放能夠避免由于植入含銅IUD 產(chǎn)生Cu2＋的暴釋而引起的不良反應(yīng)。反過來，IMC的釋放并未促進(jìn)Cu2＋的釋放，反而阻礙了Cu2＋的釋放，這與以前的關(guān)于IMC 釋放規(guī)律的研究報告并不一致［7，17］。

另外，當(dāng)DFS釋放恒定后，每24h平均釋放量約為（0.134±0.025）mg，IMC 的24h平均釋放量約為（0.675±0.175）mg，大約是DFS 的5 倍。因為DFS對COX-2的選擇性抑制作用更強，DFS的抗炎鎮(zhèn)痛作用比IMC強2～2.5倍，所以，盡管相同劑量的IMC-藥銅IUD 和DFS-藥銅IUD 的藥物釋放量有差異，但就臨床療效來說，兩者作用可能相近；而且，因為局部用藥且釋放穩(wěn)定，DFS的不良反應(yīng)發(fā)生率明顯低于IMC，耐受性也會好于后者。

從腐蝕形貌及Cu2＋釋放曲線可以看出，銅絲由于表面存在著微裂紋，在浸入模擬宮腔液的初始階段腐蝕速率很高，隨著Cu2＋的釋放，腐蝕產(chǎn)物沉積在表面，阻礙了腐蝕反應(yīng)的進(jìn)行，因此Cu2＋釋放速率曲線先上升，再下降，后期釋放速率趨于平緩。但I(xiàn)MC和DFS可能導(dǎo)致的銅絲腐蝕形貌及表面成分的差異還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，DFS因釋放穩(wěn)定，不良反應(yīng)少，耐受性好，個體差異小等優(yōu)勢有望取代IMC成為新型活性元宮型藥銅的藥物制劑，但其與載體材料的組織相容性、體內(nèi)釋放規(guī)律、遠(yuǎn)期生物安全性等問題還需要繼續(xù)研究。

［1］ 左文莉.吲哚美辛與宮內(nèi)節(jié)育器［J］.中國計劃生育學(xué)雜志，2009，17：380-381.

［2］ 高潔，李瑛，劉建平，等.活性元宮型藥銅365宮內(nèi)節(jié)育器體外釋放吲哚美辛的研究［J］.生殖與避孕，2006，26：602-605.

［3］ 吳尚純.宮內(nèi)節(jié)育器的應(yīng)用進(jìn)展［J］.國際生殖健康／計劃生育雜志，2009，28：75-77.

［4］ Bastidas JM，Cano E，Mora N.Copper corrosion-simulated uterine solutions［J］.Contraception，2000，61：395-399.

［5］ Mora N，Cano E，Mora EM，et al.Influence of pH and oxygen on copper corrosion in simulated uterine fluid ［J］.Biomaterials，2002，23：667-671.

［6］ Johnson AB Jr，Maness RF，Wheeler RG.Calcareous deposits formed on IUDs in human exposures［J］.Contraception，1976，14：507-517.

［7］ 曹變梅，奚廷斐，鄭裕東，等.元宮銅宮內(nèi)節(jié)育器銅離子釋放和細(xì)胞毒性及藥銅220吲哚美辛釋放的研究［J］.科學(xué)通報，2009，54：1350-1355.

［8］ 王益央，劉昌官.消炎痛緩釋系統(tǒng)的釋放特性與子宮相容性的初步研究［J］.生殖與避孕，1989，9：25-27.

［9］ Chandrasekharan NV，Dai H，Roos KL，et al.COX-3，a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic／antipyretic drugs：cloning，structure，and expression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99：13926-13931.

［10］ Gately S.The contributions of cyclooxygenase-2 to tumor angiogenesis［J］.Cancer Metastasis Rev，2000，19：19-27.

［11］ Bachelor MA，Silvers AL，Bowden GT.The role of p38in UVA-induced cyclooxygenase-2 expression in the human keratinocyte cell line，HaCaT ［J］.Oncogene，2002，21：7092-7099.

［12］ 費允云，張奉春.環(huán)氧酶-2選擇性抑制劑的再認(rèn)識［J］.臨床藥物治療雜志，2008，6：27-30.

［13］ Senol A，Saritas U，Demirkan H.Efficacy of intramuscular diclofenac and fluid replacement in prevention of post-ERCP pancreatitis［J］.World J Gastroenterol，2009，15：3999-4004.

［14］ 王春麗，何春妮.雙氯芬酸鈉緩釋片用于人工流產(chǎn)止痛的觀察［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24：124.

［15］ 周鳳，劉春民，韓冰，等.兒童斜視術(shù)后應(yīng)用典必舒和雙氯芬酸鈉眼藥水的療效觀察［J］.國際眼科雜志，2007，7：212-214.

［16］ 顧悅超，張勇.雙氯芬酸鈉聯(lián)合嗎啡控釋片治療轉(zhuǎn)移性骨腫瘤疼痛［J］.中國癌癥雜志，2004，14：78-79.

［17］ Jinying L，Ying L，Xuan G，et al.Investigation of the release behavior of cupric ion for three types of Cu-IUDs and indomethacin for medicated Cu-IUD in simulated uterine fluid［J］.Contraception，2008，77：299-302.