冷凍技術(shù)對(duì)精子印記基因DNA 甲基化影響的研究

楊向祎，郭穎，曹小芳，賈艷飛，王曉尉，許劍鋒，周芳，李鴻，梁小薇，盧文紅＊，谷翊群＊

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

表觀遺傳學(xué)是指在細(xì)胞核DNA 序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表型發(fā)生穩(wěn)定的可遺傳的變化。例如DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑，這些修飾可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)育及個(gè)體成熟過(guò)程中起著重要的作用，還可以遺傳給子代［1］。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要組成部分，指由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶催化，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC），即在CpG二核苷酸內(nèi)將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上。我國(guó)學(xué)者（2013）指出，精子而非卵子的DNA甲基化圖譜可遺傳給子代，子代選擇性地繼承父代而拋棄母代的DNA 甲基化圖譜，并用于指導(dǎo)胚胎早期發(fā)育［2］。胚胎早期的DNA 甲基化異?？梢詫?dǎo)致男性不育及胎兒印記基因缺陷性疾病，如Beckwith-Wiedeman 綜合征、Silver-Russell綜合征，以及Angelman 綜 合 征（Angelman syndrome，AS）／Prader-Willi 綜 合 征 （Prader-Willi syndrome，PWS）。

精子低溫冷凍保存技術(shù)已廣泛應(yīng)用于男性惡性腫瘤放化療前、輸精管絕育術(shù)前、輔助生殖技術(shù)中的自身精液或精子庫(kù)捐精的精子保存［3］。雖然隨著冷凍方法和冷凍保護(hù)劑的不斷改良，使精子的存活率有了一定提高，但對(duì)精子活力、頂體反應(yīng)發(fā)生率、形態(tài)學(xué)及授精能力仍然會(huì)造成了一些不可逆轉(zhuǎn)的影響，而對(duì)表觀遺傳方面的損傷，至今仍然沒(méi)有確切結(jié)論。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)大量報(bào)道了輔助生殖技術(shù)會(huì)影響胚胎早期發(fā)育，甚至導(dǎo)致子代因表觀遺傳學(xué)改變所致的遺傳缺陷，包括較高的生殖功能障礙、腫瘤及印記缺陷性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等［4］。印記基因DNA 甲基化程度容易受外界環(huán)境如溫度［5］、營(yíng)養(yǎng)供給［6］、重金屬［7］、早期環(huán)境刺激［8］和輻射［9］等的影響，從而發(fā)生甲基化程度的異常。冷凍技術(shù)是否會(huì)對(duì)精子印記基因DNA 甲基化程度產(chǎn)生影響鮮有報(bào)道，本研究旨在對(duì)此進(jìn)行初步探討。

材料與方法

一、樣品采集與分組

1.精液樣品收集：選取10例北京人類(lèi)精子庫(kù)符合捐精條件的正式志愿者為研究對(duì)象［10］。經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及本人知情同意，所取精液全部用于本次實(shí)驗(yàn)。依據(jù)第5版《世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》［11］，志愿者禁欲3～5d，手淫法取精，精液完整收集于無(wú)菌干燥取精杯中，置37℃水浴中液化

0.5～1h。

2.精液分組：將完全液化的精液樣品平均分為4組：A 組為0.5ml新鮮精液，作為對(duì)照；B組0.5ml新鮮精液加入0.5ml冷凍保護(hù)劑（自制），37 ℃水浴10min，不冷凍；C 組0.5 ml新鮮精液加入0.5ml冷凍保護(hù)劑，冷凍2d；D 組0.5 ml新鮮精液加0.5ml冷凍保護(hù)劑，冷凍兩個(gè)月。

二、研究方法

1.精液冷凍復(fù)蘇：本研究采用精子庫(kù)常用的甘油-卵黃-檸檬酸鹽冷凍保護(hù)劑（自制）以及液氮程控冷凍降溫法對(duì)精子進(jìn)行冷凍，復(fù)蘇時(shí)采用37℃水浴快速?gòu)?fù)溫5～10min［11］。

2.精子DNA 提?。壕覦NA 的提取使用微量全基因組DNA 提取試劑盒（Omega，美國(guó)），每500μl樣品加用配制的1 mol／L 的DTT 液20μl處理細(xì)胞膜。Nano Drop2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）檢測(cè)DNA濃度與純度（OD260／OD280），每個(gè)樣品分裝3管，標(biāo)本置于-80℃保存。

3.亞硫酸氫鹽處理：使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（Qiagen，德國(guó)）處理精子DNA，其原理為DNA序列中CpG 島內(nèi)（5mCG）甲基化胞嘧啶（C）保持不變，未甲基化的胞嘧啶（C）都轉(zhuǎn)化成尿嘧啶（U），經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增后，U 轉(zhuǎn)化為胸腺胞嘧啶（T），分析PCR 產(chǎn)物中C／T 的含量（即C 的比值）可間接定量分析甲基化程度。

4.目的片段擴(kuò)增：目的區(qū)域?yàn)镠19 印記調(diào)控區(qū)（imprinting control regions，ICR）（GenBank accession no.AF087017，nucleotides 6 005～6 326），MEST ICR（GenBank accession no.Y10620，nucle-otides 609～898）［12］，PCR 用EX Taq HotStart試劑盒（TaKaRa，日 本），50μl反 應(yīng) 體 系 為：0.25μl TaKaRa Ex Taq HS、5μl 10×Ex Taq Buffer、4μl dNT PMixture、5μl甲基化后DNA、正反向引物各2.5μl、滅菌蒸餾水30.75μl。反應(yīng)置于冰上。PCR反應(yīng)條件列于表1。

5.PCR 產(chǎn)物電泳及純化回收：配置2%的瓊脂糖凝膠，將PCR 產(chǎn)物電泳，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。使用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒（全式金）對(duì)凝膠進(jìn)行目的片段的回收。

表1 引物序列及半巢氏PCR 反應(yīng)條件

圖1 H19甲基化后DNA PCR 電泳圖

圖2 MEST 甲基化后DNA PCR 電泳圖

6.TA 克隆測(cè)序：使用pEASY-T1Cloning Kit試劑盒（全式金），進(jìn)行目的片段DNA 與質(zhì)粒的連接。加連接產(chǎn)物于50μl感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物菌液均勻涂于LB 平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色單克隆至10μl無(wú)菌水中，取1μl混合液于25μl PCR 體系，用M13通用引物進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆，將產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。挑選含陽(yáng)性單克隆菌落的菌液，加入500μl平衡至室溫的液體LB培養(yǎng)基（含Kana抗生素，自制），200r／min，37 ℃培養(yǎng)3h左右。進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas Lite 軟件（Technelysium Pty Ltd，澳大利亞）打開(kāi)，結(jié)果要求條帶清晰，無(wú)套峰等情況。采用BIQ-analyzer甲基化分析軟件（Max Planck Institution，德國(guó)）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析及質(zhì)控。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，Bonferroni法進(jìn)行多個(gè)樣品率的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、H19甲基化結(jié)果分析

1.H19ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)分析：統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)，H19總共測(cè)試了370個(gè)克隆，B、C、D 組的精子其H19ICR DNA 甲基化率以克隆數(shù)表示（甲基化克隆數(shù)占全部克隆數(shù)的百分比）時(shí)，與A 組相比，有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)CpG 島數(shù)，目的片段含21 個(gè)CpG 島，H19共測(cè)試了7 770個(gè)CpG 島，H19ICR DNA 甲基化率以CpG 島數(shù)表示（甲基化CpG 島數(shù)占全部CpG 島的百分比）時(shí)，分別與對(duì)照A 組的97.57%相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3、表2）。

2.冷凍保護(hù)劑對(duì)精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影響：H19ICR DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，加冷凍保護(hù)劑的B組與未加冷凍保護(hù)劑的對(duì)照A 組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍保護(hù)劑對(duì)精子H19ICR的DNA 甲基化程度未見(jiàn)影響。（表2）。

3.冷凍過(guò)程及冷凍時(shí)間對(duì)精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影響：H19ICR DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，冷凍的C D 組與未冷凍的B 組相比，有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；冷凍兩個(gè)月的D 組與冷凍兩天的C組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍過(guò)程及冷凍時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子H19ICR 的DNA甲基化程度未見(jiàn)影響。（表2）。

二、MEST 甲基化結(jié)果分析

1.MEST ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)分析：MEST 總 共 測(cè) 了295 個(gè) 克 隆，B、C、D 組 的 精 子MEST ICR DNA 甲基化率以克隆數(shù)表示時(shí)與對(duì)照A 組相比，有升高趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。目的片段含有31個(gè)CpG 島，MEST 共測(cè)試了9 145個(gè)CpG 島，MEST ICR DNA 甲基化率以CpG 島數(shù)表示時(shí)，分別與對(duì)照A 組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3、圖4）。

圖3 H19ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的點(diǎn)狀圖（BIQ 軟件）

表2 四組H19ICR 甲基化狀態(tài)比較［n（%）］

2.冷凍保護(hù)劑對(duì)精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影響：MEST DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，加冷凍保護(hù)劑的B組與未加冷凍保護(hù)劑的對(duì)照A 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍保護(hù)劑對(duì)精子MEST ICR的DNA 甲基化程度未見(jiàn)影響。（表3）。

3.冷凍及冷凍時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影響：MEST ICR DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，冷凍的C、D組與未冷凍的B 組相比，有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；冷凍2個(gè)月的D 組與冷凍2d的C組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍及冷凍時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度未見(jiàn)影響。（表3）。

圖4 MEST ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的點(diǎn)狀圖（BIQ 軟件）

表3 四組MEST ICR 甲基化狀態(tài)比較［n（%）］

討 論

印記基因是指同源基因中只選擇性的表達(dá)一方親本基因，另一方則不表達(dá)（最常見(jiàn)是由于DNA 甲基化），即呈現(xiàn)為差異性表達(dá)［13］。大多數(shù)印記基因都是成簇存在，通過(guò)不同的ICR 的順式作用來(lái)調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)或抑制。在許多基因啟動(dòng)子區(qū)，其CpG 二聯(lián)核苷的概率高于正常，具有調(diào)控作用，被稱為CpG 島。CpG 島的DNA 高甲基化會(huì)在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA 鏈結(jié)合，抑制基因的表達(dá)，這些區(qū)域低甲基化能促使基因表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取印記基因的ICR 區(qū)，并對(duì)此區(qū)甲基化CpG 島進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可代表整個(gè)基因的甲基化程度。

DNA 甲基化印記是周期性動(dòng)態(tài)變化的，受精后胚胎細(xì)胞中從親代遺傳來(lái)的甲基化標(biāo)記在去甲基化酶的作用下被擦除，胚胎植入子宮內(nèi)膜前，新的甲基化標(biāo)記又在基因組DNA 上重建。與普通基因組DNA 不同，印記基因ICR 區(qū)在繼承父母雙方各自的DNA 甲基化印記后，不經(jīng)歷受精后擦除、重建的過(guò)程，能穩(wěn)定地遺傳下去［14］。一旦受精前精子印記基因DNA 甲基化受外界環(huán)境如低溫冷凍的刺激而發(fā)生異常，必然會(huì)影響到早期胚胎發(fā)育甚至子代身體健康。

父源印記基因H19 定位于人染色體11p15.5區(qū)，H19ICR 甲基化異常會(huì)導(dǎo)致男性不育、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限［15］及子代印記缺陷性疾病的發(fā)生［16］。母源印記基因MEST 定位于人類(lèi)染色體7q31-34，MEST ICR 甲基化異常會(huì)導(dǎo)致Silver-Russell綜合癥（SRS）［16］的發(fā)生。因此選擇了這兩個(gè)分別來(lái)自父源和母源的目的基因開(kāi)展研究。

常用DNA 甲基化分析方法有：甲基化特異性PCR、亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法、亞硫酸鹽氫測(cè)序PCR、變性高效液相色譜、焦磷酸測(cè)序法、飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)、探針和芯片法等。本研究選擇的是亞硫酸氫鹽測(cè)序法雖然需要大量的克隆測(cè)序，過(guò)程較為繁瑣、昂貴，但可靠性及精確度很高，能明確目的片段中每個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)選取精子庫(kù)入選的正式志愿者，無(wú)遺傳性疾病家族史，無(wú)外傷及性功能障礙史，并進(jìn)行了染色體核型分析，排除了少、弱精子癥及染色體核型異常等因素的干擾。Collodel等［17］報(bào)道，冷凍保護(hù)劑會(huì)通過(guò)氧化應(yīng)激對(duì)精子線粒體等微結(jié)構(gòu)造成損傷。因此，本研究設(shè)置了未加保護(hù)劑的A 組和加保護(hù)劑的B組，本結(jié)果顯示，保護(hù)劑的使用未對(duì)DNA 甲基化造成明顯影響。Flores等［18］報(bào)道，冷凍對(duì)精子線粒體相關(guān)功能及蛋白的損傷是時(shí)間依賴性的。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)冷凍2d的C 組及冷凍2個(gè)月D組的比較，隨著冷凍時(shí)間延長(zhǎng)，DNA 甲基化程度有增高趨勢(shì)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。國(guó)外學(xué)者用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)冷凍4周的精子，檢測(cè)了9個(gè)基因，其結(jié)果亦未見(jiàn)影響［19］，本文與其檢測(cè)的結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)研究了冷凍技術(shù)、精液冷凍保護(hù)劑及冷凍時(shí)間對(duì)精子DNA 甲基化的影響，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯示這些因素都未對(duì)精子印記基因DNA 甲基化產(chǎn)生影響，但H19DNA 甲基化程度隨著冷凍時(shí)間延長(zhǎng)有降低趨勢(shì)，MEST DNA 甲基化程度隨冷凍時(shí)間延長(zhǎng)有升高趨勢(shì)，且3號(hào)志愿者M(jìn)EST DNA 甲基化出現(xiàn)了異質(zhì)性，說(shuō)明冷凍技術(shù)可能對(duì)某些特定人群DNA 甲基化產(chǎn)生影響。受條件限制，本實(shí)驗(yàn)冷凍時(shí)間未達(dá)到臨床保存所需的時(shí)間要求。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可通過(guò)擴(kuò)大樣品量、延長(zhǎng)冷凍時(shí)間及增加候選基因個(gè)數(shù)，進(jìn)一步研究與分析個(gè)體差異，為精子冷凍保護(hù)劑的改良、冷凍保存安全性評(píng)估提供參考依據(jù)。

致謝：感謝國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所出生缺陷干預(yù)實(shí)驗(yàn)室王啟迪、曹小芳、郭昌龍等對(duì)本實(shí)驗(yàn)提供的技術(shù)支持。

［1］ Beaujean N.Epigenetics，embryo quality and developmental potential［J］.Reprod Fertil Dev，2014，27：53-62.

［2］ Jiang L，Zhang J，Wang JJ，et al.Sperm，but not oocyte，DNA methylome is inherited by zebrafish early embryos［J］.Cell，2013，153：773-784.

［3］ Jensen JR， Morbeck DE，Coddington CC.Fertility preservation［J］.Mayo Clin Proc，2011，86：45-49.

［4］ Talaulikar VS，Arulkumaran S.Reproductive outcomes after assisted conception［J］.Obstet Gynecol Surv，2012，67：566-583.

［5］ Navarro-Martín L，Vi?as J，Ribas L，et al.DNA methylation of the gonadal aromatase（cyp19a）promoter is involved in temperature-dependent sex ratio shifts in the European sea bass［J／OL］.PLoS Genet，2011，7：e1002447.

［6］ Lyko F，F(xiàn)oret S，Kucharski R，et al.The honey bee epigenomes：differential methylation of brain DNA in queens and workers［J／OL］.PLoS Biol，2010，8：e1000506.

［7］ Baccarelli A，Bollati V.Epigenetics and environmental chemicals［J］.Curr Opin Pediatr，2009，21：243-251.

［8］ Beach SRH，Brody GH，Todorov AA，et al.Methylation at SLC6A4is linked to family history of child abuse：an examination of the Iowa Adoptee sample［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2010，153B：710-713.

［9］ Aypar U，Morgan WF，Baulch JE.Radiation-induced epigenetic alterations after low and high LET irradiations［J］.Mutat Res，2011，707：24-33.

［10］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.人類(lèi)精子庫(kù)基本標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范［S］.中國(guó)生育健康雜志，2004，15：68-71.

［11］ WHO（谷翊群，陳振文，盧文紅，等譯）.世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)［S］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：5-7.

［12］ Poplinski A，Tüttelmann F，Kanber D，et al.Idiopathic male infertility is strongly associated with aberrant methylation of MEST and IGF2／H19ICR1［J］.Int J Androl，2010，33：642-649.

［13］ Koerner MV，Barlow DP.Genomic imprinting-an epigenetic gene-regulatory model［J］.Curr Opin Genet Dev，2010，20：164-170.

［14］ Hiura H，Okae H，Chiba H，et al.Imprinting methylation errors in ART［J］.Reprod Med Biol，2014，13：193-202.

［15］ Turner CL，Mackay DM，Callaway JL，et al.Methylation analysis of 79patients with growth restriction reveals novel patterns of methylation change at imprinted loci［J］.Eur J Hum Genet，2010，18：648-655.

［16］ Azzi S，Abi HW，Netchine I.Beckwith-Wiedemann and Russell-Silver syndromes：from new molecular insights to the comprehension of imprinting regulation［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2014，21：30-38.

［17］ Collodel G，F(xiàn)ederico MG，Geminiani M，et al.Effect of transresveratrol on induced oxidative stress in human sperm and in rat germinal cells［J］.Reprod Toxicol，2011，31：239-246.

［18］ Flores E， Fernandez-Novell JM， Pena A， et al.Cryopreservation-induced alterations in boar spermatozoa mitochondrial function are related to changes in the expression and location of midpiece mitofusin-2 and actin network［J］.Theriogenology，2010，74：354-363.［19］ Klaver R，Bleiziffer A，Redmann K，et al.Routine cryopreservation of spermatozoa is safe--evidence from the DNA methylation pattern of nine spermatozoa genes［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：943-950.