黑莓果酒中蛋白質(zhì)提取方法研究

梁紅云　王英　李清　董明盛　周劍忠

摘要：以實(shí)驗(yàn)室自釀的黑莓果酒為原料，采用無水乙醇沉淀法、透析凍干法和KDS法分別提取黑莓果酒中的總蛋白質(zhì)，利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度以及SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的純度，并比較3種方法之間的差異。結(jié)果表明，無水乙醇沉淀法的蛋白質(zhì)提取率較高，SDS-PAGE圖譜顯示條帶最多、最清晰；透析凍干法的蛋白質(zhì)提取率最高，但SDS-PAGE圖譜中呈現(xiàn)的條帶較無水乙醇沉淀法少，條帶不清晰，背景顏色較深；KDS沉淀法的蛋白質(zhì)提取率最低，SDS-PAGE圖譜中呈現(xiàn)的條帶最少、最不清晰。3種方法中無水乙醇沉淀法最適于黑莓果酒中總蛋白質(zhì)的提取。

關(guān)鍵詞：黑莓果酒；蛋白質(zhì)；提取方法；SDS-PAGE

中圖分類號： TS262.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0349-03

隨著人們生活水平提高和保健意識增強(qiáng)，以葡萄酒為代表的果酒，其營養(yǎng)價(jià)值得到廣泛認(rèn)可。黑莓果實(shí)柔嫩多汁、營養(yǎng)豐富，富含鋅、硒等多種礦物質(zhì)，氨基酸種類齊全，且花色苷和總酚含量較其他漿果高，被譽(yù)為第三代“黃金水果”。其所含的多酚類化合物在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，可以降低心臟病、癌癥和其他慢性病的發(fā)生率[1-2]。但是黑莓的果實(shí)皮薄多汁，易發(fā)生霉?fàn)€，耐儲運(yùn)能力較差，室內(nèi)條件下存放2～3 d后果實(shí)即變軟發(fā)黏，而且果實(shí)不耐搬運(yùn)和翻動，因此對黑莓鮮果必須及時加工處理，并且黑莓為高酸型水果，不宜鮮食，有較強(qiáng)的加工屬性，將其制成黑莓果酒將具有巨大的市場潛力。

作為一種商品，果酒的澄清度是決定其品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，澄清透明、顏色清亮的果酒商品容易吸引消費(fèi)者的眼球。雖然渾濁或帶有沉淀的果酒對人體健康沒有影響，但影響消費(fèi)者的購買欲，進(jìn)而影響銷售市場，因此，不論儲存條件如何，果酒必須保持較高的澄清度和穩(wěn)定性才能保持果酒的商品價(jià)值。果酒的澄清工藝及澄清劑的研制是目前的研究熱點(diǎn)[3-6]。

總體來說，引起果酒渾濁沉淀的因素分為生物因素和非生物因素。針對生物因素，在加工和儲存的過程中須嚴(yán)格控制衛(wèi)生管理。非生物因素是引起果酒渾濁及沉淀的主因，也是在釀造工藝上必須重點(diǎn)探討解決的技術(shù)難點(diǎn)。從已有的研究結(jié)果來看，果酒中的蛋白質(zhì)是引起果酒渾濁的一個主要非生物因素，果酒中的蛋白質(zhì)含量較低，不是果酒中的主要營養(yǎng)成分，但對果酒的澄清度和穩(wěn)定性有重要影響，因?yàn)楣蒲b瓶儲存過程中蛋白質(zhì)的緩慢降解導(dǎo)致蛋白質(zhì)絮凝和聚集成顆粒，最終導(dǎo)致果酒的渾濁和沉淀[7-9]。大部分研究者認(rèn)為果酒中蛋白質(zhì)是引起果酒渾濁的一個必要因素，且蛋白質(zhì)的含量越高，果酒越容易不穩(wěn)定，越易發(fā)生渾濁沉淀現(xiàn)象，因此，果酒中的蛋白質(zhì)對果酒的渾濁和沉淀都具有貢獻(xiàn)作用[10-11]。

目前對葡萄果酒中蛋白質(zhì)的提取主要采用的方法有無水乙醇沉淀法、丙酮沉淀法、TCA沉淀法、硫酸銨沉淀法、凍干透析法、十二烷基磺酸鈉和氯化鉀沉淀法（KDS）[12-13]。本研究選擇常用的無水乙醇沉淀法、透析凍干法、十二烷基磺酸鈉和氯化鉀沉淀法（KDS）對黑莓果酒中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，通過比較3種方法中蛋白質(zhì)提取率和提取純度，旨在找出一種簡便快捷高效的黑莓果酒蛋白質(zhì)提取方法，為研究黑莓果酒中蛋白質(zhì)組分如何引起黑莓果酒沉淀提供可靠的方法，同時對充分開發(fā)利用我國的黑莓資源、提高農(nóng)產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

黑莓初酒為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所釀造。果酒釀造采取2種方式：一種為在黑莓打漿后添加0.1%果膠酶45 ℃酶解2 h；另一種位黑莓打漿后不添加果膠酶。其他的釀造條件一致。果酒未經(jīng)澄清劑處理。

1.2 試劑與儀器

試劑：無水乙醇、丙酮、SDS均購自南京化學(xué)試劑有限公司；KCl，西隴化工股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；以上試劑均為分析純。3.5 ku的透析袋，USA。

儀器：FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)（東京理化/EYELA）；UV-1600PC分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）；SDS-PAGE電泳儀（BIO-RAD公司）；Tanon3500全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑莓果酒的前處理 分別取適量未加果膠酶和加果膠酶的黑莓酒樣品4 ℃條件下3 000 g離心10 min，去除不溶性的大顆粒物質(zhì)。棄沉淀，上清備用。

1.3.2 無水乙醇沉淀法 參照Lambri等的方法[14]，稍作修改，具體操作步驟如下：分別量取經(jīng)離心處理的50 mL未加果膠酶和加果膠酶的黑莓酒樣品，加入200 mL 無水乙醇，于4 ℃條件下沉淀72 h后，10 000 g 離心20 min，收集沉淀，重懸于超純水中，于3.5 ku的透析袋中透析48 h，，每隔4 h換1次雙蒸水。然后于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，用5 mL蒸餾水分別溶解未加果膠酶和加果膠酶黑莓酒的蛋白質(zhì)凍干樣品，所得蛋白質(zhì)樣品放置在-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 透析凍干法 參照Marangon等的方法[15]，稍作修改，具體操作步驟如下：分別量取經(jīng)離心處理的50 mL未加果膠酶和加果膠酶的黑莓酒于3.5 ku的透析袋中，透析48 h后，于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，用5 mL蒸餾水分別溶解未加果膠酶和加果膠酶黑莓酒的蛋白質(zhì)凍干樣品，所得蛋白質(zhì)樣品放置在-20 ℃冰箱中備用。

1.3.4 十二烷基磺酸鈉和氯化鉀沉淀法（KDS） 參照Fusi等的方法[16]，稍作修改，具體操作步驟如下：分別量取經(jīng)離心處理的50 mL未加果膠酶和加果膠酶的黑莓酒，10%（質(zhì)量濃度）十二烷基磺酸鈉（SDS）加入到黑莓酒樣品中，使其終濃度為0.2% （質(zhì)量濃度），沸水浴5 min，然后將2 moL/L的KCl溶液加入到樣品中，使其終濃度為400 mmol/L，輕輕混勻樣品后將混合液在4 ℃條件下放置45 min，4 ℃條件下14 000 g 離心15 min，收集沉淀，即為提取的蛋白質(zhì)樣品。將所得樣品自然干燥后，分別用5 mL蒸餾水溶解未加果膠酶和加果膠酶黑莓酒的蛋白質(zhì)凍干樣品，所得蛋白質(zhì)樣品放置在-20 ℃冰箱中備用。endprint

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測定 參照Lambri等的方法[14]對提取的總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，以牛血清蛋白質(zhì)（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)G-250染色，然后于595 nm波長處比色，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0083x-0.0009，r2=0.9964，結(jié)果用 mg/L表示。提取蛋白質(zhì)樣品冷凍干燥后加入一定體積的蒸餾水溶解，再用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，在595 nm波長處比色。每個樣品蛋白質(zhì)含量均取3次測定結(jié)果的平均值。

1.3.6 蛋白質(zhì)提取率 蛋白質(zhì)提取率=（提取液的蛋白質(zhì)含量×蛋白質(zhì)提取液體積）/（黑莓酒蛋白質(zhì)含量×黑莓酒樣品體積）×100%。

1.3.7 SDS-PAGE分析提取的果酒蛋白質(zhì) SDS-PAGE電泳采用12.5%（體積分?jǐn)?shù)）的聚丙烯酰胺凝膠作為分離膠，5% （體積分?jǐn)?shù)）的聚丙烯酰胺凝膠作為濃縮膠。凍干的蛋白質(zhì)提取樣品加入一定量的蒸餾水溶解，5×樣品緩沖液[0.5 mol/L Tris-HC1，pH值6.8，20%（體積分?jǐn)?shù)）甘油，4%（質(zhì)量濃度）SDS，0.005% （質(zhì)量濃度）溴酚藍(lán)，10% （體積分?jǐn)?shù)）β-巰基乙醇]稀釋5倍后，與蛋白質(zhì)提取液按1 ∶ 1的體積比混合，沸水浴5 min，使蛋白質(zhì)變性，上樣量為20 μL，濃縮膠內(nèi)電泳時設(shè)置電壓為80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)線到達(dá)分離膠時把電壓提高到120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)線到達(dá)分離膠底部時停止電泳。蛋白質(zhì)檢測用硝酸銀溶液染色，再用Tanon3500全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總蛋白質(zhì)提取效果的比較

從表1可以看出，在3種方法中，透析凍干法提取的蛋白質(zhì)含量和提取率最高，未加酶黑莓酒蛋白質(zhì)含量為（484.34±23.51） mg/L，提取率達(dá)到66.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），加酶黑莓酒蛋白質(zhì)含量為（630.60±29.74） mg/L，提取率達(dá)到67.01%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；無水乙醇沉淀法提取的蛋白質(zhì)含量較高，未加酶黑莓酒蛋白質(zhì)含量為（438.37±23.68） mg/L，提取率達(dá)到60.65%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），加酶黑莓酒蛋白質(zhì)含量為（596.39±32.73） mg/L，提取率達(dá)到62.43%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；KDS沉淀法的提取量和提取率最低，未加酶黑莓酒蛋白質(zhì)含量為（278.57±17.02） mg/L，提取率為30.19%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），加酶黑莓酒蛋白質(zhì)含量為（314.02±11.54） mg/L，提取率僅為32.87%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。 因此，從蛋白質(zhì)含量和提取率的比較結(jié)果可以看出，無水乙醇沉淀法和透析凍干法的效果較好，KDS法的提取效果最差。

2.2 SDS-PAGE分析提取的藍(lán)莓酒蛋白質(zhì)

3種方法提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測和圖譜分析分別見圖1和表2。從圖1、表2可以看出，提取蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布在40～170 ku，但3種方法所獲得的蛋白質(zhì)在凝膠電泳中顯示的條帶數(shù)目、背景顏色以及清晰度均存在差異。無水乙醇沉淀的蛋白質(zhì)條帶最多、最清晰，背景顏色也較淺，未加酶的黑莓酒蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量多集中在100、70、20 ku左右，顯示3條帶，加酶黑莓酒的條帶較多，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量多集中在40～170 ku，顯示5條帶；透析凍干法提取的蛋白質(zhì)不純，背景顏色很深，未加酶的黑莓酒蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量多集中在100 ku和70 ku左右，顯示2條帶，加酶黑莓酒的條帶較多，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量多集中在40～170 ku，顯示4條帶；KDS法提取的蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜中呈現(xiàn)的條帶最少、最不清晰，加酶和未加酶的黑莓酒蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量在70 ku和 20 ku左右，只顯示2條帶。果膠酶的條帶多且集中，相對分子質(zhì)量多集中在40～170 ku，與加酶黑莓酒中的條帶較一致，說明在釀酒工藝的酶解過程中所添加的果膠酶是黑莓酒中的蛋白質(zhì)的一個重要組成部分。從蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳結(jié)果來看，無水乙醇沉淀法提取的蛋白質(zhì)的純度最高，雜質(zhì)最少；透析凍干法提取的蛋白質(zhì)里的雜質(zhì)較多；KDS法提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量最差。

3 結(jié)論

本研究通過無水乙醇沉淀法、透析凍干法和KDS法提取黑莓酒中的蛋白質(zhì)，對得到的總蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量和SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示如下：

（1）蛋白質(zhì)含量和提取率的分析結(jié)果顯示，透析凍干法提取效果最高，無水乙醇法次之，，兩者的提取率都在60%以上；KDS法的提取效果最差，提取率為30%左右。

（2）SDS-PAGE電泳顯示黑莓果酒的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布在40～170 ku，未加酶的黑莓酒蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量多集中在70～100 ku。在果酒的釀造過程中酶解處理會增加果酒中的蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)種類。

（3）無水乙醇沉淀法獲得的蛋白質(zhì)純度最高，條帶最清晰；凍干透析法獲得的蛋白質(zhì)，凍干后有很大一部分黏稠物不能復(fù)溶，雜質(zhì)太多，雖然含量最高，但其背景顏色太深，條帶不清晰；KDS法獲得的蛋白質(zhì)含量最低，條帶最少，染色最弱，最不清晰。

樣品制備是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響后續(xù)的SDS-PAGE電泳效果，尤其針對黑莓果酒這樣低蛋白質(zhì)含量的原料，確定理想的蛋白質(zhì)提取方法對蛋白質(zhì)電泳非常重要。綜合以上結(jié)果，確定無水乙醇沉淀法為黑莓果酒中總蛋白質(zhì)提取的最適方法。

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