β-內(nèi)酰胺酶E166C突變型的原核表達(dá)、純化及鑒定

【軍事醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生裝備】

β-內(nèi)酰胺酶E166C突變型的原核表達(dá)、純化及鑒定

肖美芳，王昌富，周義正，邱曉燕

(華中科技大學(xué)附屬荊州醫(yī)院, 湖北 荊州434020)

摘要：目的本研究旨在構(gòu)建β-內(nèi)酰胺酶E166C突變體并于大腸桿菌中原核表達(dá)，純化及鑒定該蛋白。方法利用體外PCR擴(kuò)增獲得β-內(nèi)酰胺酶penP突變質(zhì)粒并通過DNA測(cè)序鑒定，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) 中，以IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。菌液超聲裂解后首先以鎳柱純化融合蛋白，蛋白水解酶 HRV3C 除去融合標(biāo)簽，然后用凝膠過濾層析色譜進(jìn)一步純化得到目標(biāo)蛋白，最后應(yīng)用SDS-PAGE和電噴霧質(zhì)譜法鑒定純化的目標(biāo)蛋白。結(jié)果成功構(gòu)建了β-內(nèi)酰胺酶penP-E166C突變質(zhì)粒，并且先后通過親和鎳柱和凝膠過濾層析柱純化獲得了純度非常高的單一蛋白，SDS-PAGE和電噴霧質(zhì)譜法確定蛋白的分子量與理論值一致。結(jié)論本課題獲得的penP的活性位點(diǎn)突變體E166C蛋白將用于以后進(jìn)一步的研究，可以有助于我們從分子水平上去研究抗生素和β-內(nèi)酰胺酶的相互作用。

關(guān)鍵詞：β-內(nèi)酰胺酶E166C突變體；PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)突變；蛋白純化及鑒定

收稿日期：2015-01-12

作者簡(jiǎn)介：肖美芳(1982—)，女，碩士研究生。主要從事細(xì)菌耐藥性研究。

doi:10.11809/scbgxb2015.06.039

中圖分類號(hào)：R961

文章編號(hào)：1006-0707(2015)06-0153-05

本文引用格式：肖美芳，王昌富，周義正，等.β-內(nèi)酰胺酶E166C突變型的原核表達(dá)、純化及鑒定[J].四川兵工學(xué)報(bào)，2015(6):153-156.

Citationformat:XIAOMei-fang,WANGChang-fu,ZHOUYi-zheng,etal.ProteinExpression,PurificationandIdentificationofβ-LactamasePenP-E166CWildtypeandMutants[J].JournalofSichuanOrdnance,2015(6):153-156.

ProteinExpression,PurificationandIdentificationof

β-LactamasePenP-E166CWildtypeandMutants

XIAOMei-fang,WANGChang-fu,ZHOUYi-zheng,QIUXiao-yan

(JingzhouCentralHospitalAffiliatedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Jingzhou434020,China)

Abstract:Objective This study was aimed to construct β-lactamase penP-E166C mutant and over-express it in E.coli, followed by purification and characterization. Method The plasmid of mutated β-lactamase penP was successfully amplified by PCR-mediated mutagenesis, which was then confirmed by DNA sequencing. The confirmed plasmids were firstly transformed into competent BL21(DE3) cells and the positive colonies were selected by antibiotics kanamycin, which were then induced by the addition of IPTG. The bacterial cells were firstly liaised by sonication, followed by Ni2+-affinity column purification, protease 3C digestion and gel filtration column purification to obtain target protein. The proteins were characterized by SDS-PAGE and ESI-mass spectrometry. Results We successively constructed penP-E166C mutant and purified this protein by Ni2+-affinity column and gel filtration column. SDS-PAGE and ESI-mass spectrometry further identified the protein molecular weight was consistent with theoretical value. Conclusion The obtained penP-E166C protein with mutation at the active site will be used in later study, which will help us to understand the interaction between antibiotics and β-lactamase better.

Keywords:β-lactamase-penPmutant;PCR-mediatedpointmutagenesis;proteinpurificationandcharacterization

β-內(nèi)酰胺類抗生素 (β-lactamantibiotics)由于抗菌作用強(qiáng)，毒性低是目前臨床抗感染治療最普遍的一類抗生素。β-內(nèi)酰胺類抗生素可以不可逆地結(jié)合到青霉素結(jié)合蛋白(PBPs的活性部位，而使其失活。由于PBPs是一組細(xì)菌細(xì)胞壁合成的關(guān)鍵酶，抑制其活性就會(huì)然阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)菌滲透裂解然后死亡[1,2]。β-內(nèi)酰胺類抗生素的優(yōu)勢(shì)是它可以選擇性的作用于快速分裂的細(xì)菌，而作為宿主的人類細(xì)胞因?yàn)闆]有細(xì)胞壁就會(huì)不受影響。隨著抗生素的廣泛使用(尤其是吳用和濫用)以及致病菌的進(jìn)化，使得耐藥性傳染病菌不斷涌現(xiàn)和全球蔓延，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[3]。最近，數(shù)株肺炎克雷伯菌更被確定為具有超廣譜抗性，幾乎可以抵抗所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素，甚至包括“最后的”防線碳青霉烯類抗生素[4]。這些所謂“超級(jí)病菌”的耐藥菌株，由于治療難度很高，導(dǎo)致住院時(shí)間延長(zhǎng)并增加感染的廣泛傳播的機(jī)會(huì)，從而給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來巨大的風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)菌可以通過多種方式獲得對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素抗藥性，包括突變青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的活性位點(diǎn)，使β-內(nèi)酰胺不能結(jié)合到它的作用靶點(diǎn);或者是增加外排，泵出侵入細(xì)菌的抗生素；又或是表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶來使抗生素失活[5,6]。其中，β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是最重要的，也是最多被研究細(xì)菌耐藥性的機(jī)制。β-內(nèi)酰胺酶可以通過細(xì)菌染色體嵌入基因或者是通過水平基因轉(zhuǎn)移而獲得，這些酶可以水解抗生素獨(dú)特的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使他們不能有效結(jié)合到PBPs而失去活性。研究表明，雖然β-內(nèi)酰胺酶的總數(shù)高得驚人并在不斷增長(zhǎng)，但是這些酶的許多成員之間可能只有很小的差別，只有一個(gè)或幾個(gè)熱點(diǎn)氨基酸殘基發(fā)生了突變，從而導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變，繼而其作用底物譜也發(fā)生改變[7]。

penP，TEM-1和SHV-1系列是A類β-內(nèi)酰胺酶的典型代表，其與90%革蘭陰性菌對(duì)青霉素耐藥性相關(guān)[8]。penP，其與TEM-1和SHV-1的序列相似性高，熱穩(wěn)定性高(Tm～ 65 ℃) ，使得它可以廣泛用于突變與酶結(jié)構(gòu)，酶活性關(guān)系方面的研究[6-7]。氨基酸殘基E166是β-內(nèi)酰胺酶penP的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，其作為一般堿，與酶的水解活性密切相關(guān)[8]。本研究擬構(gòu)建penP-E166C的突變質(zhì)粒并純化突變體蛋白，為今后的結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供蛋白來源。結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)將會(huì)進(jìn)一步弄清影響β-內(nèi)酰胺酶活性的關(guān)鍵氨基酸殘基提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為將來設(shè)計(jì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，逆轉(zhuǎn)抗生素廣譜耐藥性提供重要的理論依據(jù)[9]。

1材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

感受態(tài)大腸桿菌DH5α和BL21DE3 購買自Invitrogen，包含Penp全長(zhǎng)序列的質(zhì)粒pRset-K_6xHis_TEV_PenP由本科室保存。

1.2主要儀器與試劑

梯度PCR儀( 美國Bio-Rad公司)， 瓊脂糖水平電泳儀( 北京市六一儀器廠)，凝膠掃描成像系統(tǒng)( 美國Bio-Rad公司)，蛋白質(zhì)垂直電泳槽( 美國Bio-Rad公司) ，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)( 德國Eppendorf公司)，His-trapHP型鎳離子親和層析柱(美國GE公司)，HiLoad16/60,superdex75 凝膠過濾色譜柱 (美國GE公司)，AKTA快速蛋白純化色譜儀(美國GE公司)。

PhuDNA聚合酶，BamHI,EcoRI限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均為Fermentas產(chǎn)品、、瓊脂糖凝膠DNA回收，質(zhì)粒提取試劑盒購自上海桑尼生物科技有限公司產(chǎn)品。引物合成、質(zhì)粒測(cè)序均委托北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3PCR介導(dǎo)的Penp基因體外定點(diǎn)突變

以pRset-K_6xHis_TEV_PenP為模板和table1中所列的引物，QuickChangeSite-DirectedMutagenesis試劑盒(Strategene)進(jìn)行PCR介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變。PCR組分和反應(yīng)程序見table2 和table3.PCR結(jié)束后加入1μLDpnⅠ酶消化原始模板。將消化后產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α,以含50μg/mL卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，突變子最終通過測(cè)序確定。

表1　引物列表

表2　 PCR反應(yīng)各組分配比

表3　 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)程序

1.4重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序鑒定正確的突變型pRset-K_6xHis_TEV_PenP_E166C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21DE3，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃,250rpm孵育過夜。次日，按1∶100的比例接種至新鮮的含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至A600nm=0.5～0.7時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，離心收集菌體，置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5Penp蛋白的純化

1.5.1His-Trap親和柱純化融合蛋白6xHis_TEV_PenP_E166C

離心收集完成誘導(dǎo)的菌體，以50mL的冰預(yù)冷緩沖液(50mMTris,150mMNaCl,pH8.0,1mMPMSFand10mMbeta-mecaptoethanol,) 重懸菌體。冰浴超聲裂菌20min，使融合蛋白完全釋放。將超聲破碎后的菌體懸液以20 000rpm/min4℃離心1h，收集上清，利用AKTA-FPLC系統(tǒng)純化。首先將裂解上清液上到5mLHis-trapHP親和柱上，然后用20倍柱體積平衡液(20mMsodiumphosphate,500mMNaCl,40mMimidazole,pH7.4)清洗純化柱，再用洗脫液(20mMsodiumphosphate,500mMNaCl,500mMimidazole,pH7.4)洗脫6xHis_TEV_PenP_E166C融合蛋白。

洗脫液用超濾離心管濃縮至4mL，然后加入100μL蛋白水解酶TEV4℃酶切。酶切反應(yīng)溶液再次上樣到親和色譜柱，6XHis標(biāo)簽將結(jié)合到鎳柱，而目標(biāo)蛋白將隨washbuffer流出，收集含有目標(biāo)蛋白的流出液，并濃縮樣品至2mL。

1.5.2凝膠過濾層析色譜純化目標(biāo)蛋白PenP_E166C

首先，HiLoad16/60,superdex75層析柱連接到AKTA蛋白純化系統(tǒng)，先后用120mL去離子水和緩沖液(50mMTris-Hcl,150mMNaCl,PH8.0)平衡；然后將2mL酶切后的樣品上樣，用上述緩沖液洗脫，洗脫速度為1mL/min，根據(jù)洗脫液的紫外吸收信號(hào)自動(dòng)收集洗脫組分。目標(biāo)組分濃縮，封裝，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1Penp—E166C突變體的構(gòu)建和鑒定

以pRset-K_6xHis_TEV_PenP質(zhì)粒為模板，分別利用攜帶突變堿基的引物對(duì)(table1)，經(jīng)PCR-介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變方法，獲得目的片段約6kb大小的PCR產(chǎn)物。DpnI降解模板后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，陽性單克隆抽提的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果用Expasytranslate工具翻譯成氨基酸序列(圖1)顯示突變體成功構(gòu)建。

圖1　6 xHis_TEV_PenP_E166 C的蛋白質(zhì)序列

2.26 xHis_TEV_PenP_E166 C 融合蛋白的表達(dá)和純化

利用pRset-K載體表達(dá)外源蛋白時(shí)，融合蛋白N端含有6XHis標(biāo)簽，可以利用Ni-NTA層析柱進(jìn)行純化。表達(dá)菌破碎后上清經(jīng)親和層析得到唯一的洗脫峰(圖2)即為 6xHis_TEV_PenP融合蛋白。蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分析(圖3)，蛋白分子量經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)為31.225kDa，與理論值一致(圖4)。

親和色譜柱為 GE公司的 HiTrap鎳柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

泳道1是低范圍分子量標(biāo)記;泳道2是上樣到柱上之前的樣品;泳道3經(jīng)由色譜柱流出的樣品;泳道4是從柱上洗出未結(jié)合的蛋白;泳道5至10分別從柱上洗脫下來的不同組分

圖312%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析親和層析

過程中的每個(gè)樣品

圖4　融合蛋白6 xHis_TEV_PenP_E166 C的質(zhì)譜圖

2.3目標(biāo)蛋白 Penp_E166 C的純化

由于在6XHis標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白PenP之間存在著proteaseTEV的酶切位點(diǎn)，可以利用TEV蛋白水解酶切下6XHis標(biāo)簽,酶切反應(yīng)時(shí)間通過SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6小時(shí)后反應(yīng)完全基本水解 (圖5)。酶水解反應(yīng)物再一次通過Ni-NTA層析柱進(jìn)行純化，從而6XHis標(biāo)簽結(jié)合到親和柱，而目標(biāo)蛋白被洗脫(圖6)。洗脫液濃縮后進(jìn)一步通過凝膠過濾層析色譜柱,目標(biāo)蛋白以單一峰從凝膠色譜柱上洗脫出來(圖7),質(zhì)譜結(jié)果顯示蛋白的分子量為29.607Kda(圖8),與理論分子量一致。

泳道1是低范圍分子量標(biāo)記；泳道2是未裂解的融合蛋白；泳道3至5分別是2、4、6小時(shí)酶切的樣品

圖512%聚丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測(cè)TVE不同時(shí)間點(diǎn)

酶切6xHis-TEV-penP的過程

圖6　目標(biāo)蛋白 TEV_PenP_E166 C的洗脫曲線

圖7　目標(biāo)蛋白 TEV_PenP_E166 C凝膠過濾層析曲線

圖8　目標(biāo)蛋白 PenP_E166 C的質(zhì)譜圖

3結(jié)論

本研究主要涉及β-內(nèi)酰胺酶PenP的突變體PenP_E166C的質(zhì)粒構(gòu)建、原核表達(dá)、純化和鑒定。利用PCR-介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變獲得pRset-K_6xHis_TEV_PenP_E166C質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲裂解細(xì)菌后經(jīng)Ni-NTA親和柱層析柱獲得融合蛋白6xHis_TEV_PenP_E166C，經(jīng)TEV水解去除融合標(biāo)簽6xHis，經(jīng)gelfiltration凝膠過濾層析色譜柱獲得目標(biāo)蛋白PenP_E166C。證實(shí)了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并獲得高純度PenP_E166C蛋白的可行性。

隨著抗生素的使用日益增多，新的廣譜β-內(nèi)酰胺酶在世界各地不斷被發(fā)現(xiàn)，其衍變規(guī)律還有待于進(jìn)一步揭示。從分子水平上對(duì)β-內(nèi)酰胺酶與抗生素相互作用的機(jī)制、產(chǎn)酶基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行更深入研究。本課題獲得的penP的活性位點(diǎn)突變體E166C，將用于培養(yǎng)酶-抗生素復(fù)合物的蛋白晶體，用X-射線晶體衍射儀分析復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)[10]。此研究將從分子水平解釋了靶標(biāo)和藥物之間的相互作用模式，對(duì)基于該靶標(biāo)設(shè)計(jì)新型β-內(nèi)酰胺類抗生素的研究起著重大作用。同時(shí)這些研究方法和結(jié)果對(duì)今后進(jìn)一步研究其他型β-內(nèi)酰胺酶家族以及其與β-內(nèi)酰胺類抗生素尤其是第3代、第4代頭孢菌素和單酰胺環(huán)類抗生素的相互作用機(jī)理提供了新的思路，也為解決臨床新型抗生素的設(shè)計(jì)問題提供了參考[11]。

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(責(zé)任編輯何杰玲)