蘭花種子萌發(fā)研究進(jìn)展及對國蘭雜交育種的啟示

李風(fēng)童　包建忠　孫葉　劉春貴　馬輝　張?zhí)稹￡愋闾m

摘要：綜述了中國蘭花育種概況以及蘭花種子萌發(fā)研究現(xiàn)狀，對共生萌發(fā)及非共生萌發(fā)技術(shù)在蘭花種子萌發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，重點(diǎn)闡述了種子胚胎發(fā)育特點(diǎn)及發(fā)育階段對種子非共生萌發(fā)的影響，指出了深入研究國蘭種子胚胎發(fā)育特性的必要性，旨在為今后促進(jìn)中國蘭花育種提供參考。

關(guān)鍵詞：蘭花；種子萌發(fā)；胚胎發(fā)育；中國蘭花育種

中圖分類號(hào)： S682.310.36 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0013-03

廣義的蘭花是整個(gè)蘭科（Orchidaceae）植物的總稱，是目前單子葉植物中最大的一個(gè)科，同時(shí)也是單子葉植物中最進(jìn)化的一個(gè)科。蘭花廣泛分布于全世界各地，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有800個(gè)屬，30 000～35 000個(gè)種[1]。國蘭特指中國境內(nèi)蘭屬（Cymbidium Sw.）植物部分地生種，中國是蘭屬植物的分布中心，目前已記載有49種，其中19種為特有種[2]。中國蘭作為中國的傳統(tǒng)名花，因其株型典雅、花姿優(yōu)美、幽香四溢，自古以來深受人們的喜愛，主要以春蘭 [C. goeringii （Rchb. f.） Rchb. f.]、蕙蘭（C. faberi Rolfe）、建蘭 [C. ensifolium （L.） Sw.]、墨蘭 [C. sinense （Jackson ex Andr.） Willd.]、寒蘭（C. kanran Mak.）等地生蘭為代表[3]。

蘭花因其重要的觀賞、經(jīng)濟(jì)及科研等價(jià)值，種子萌發(fā)機(jī)理一直是各國蘭科植物學(xué)家所研究的熱點(diǎn)之一，為部分瀕危蘭花的保育及重要觀賞蘭花的育種作出了重要貢獻(xiàn)，但部分地生蘭種子萌發(fā)機(jī)理仍然是當(dāng)前研究的難點(diǎn)，國蘭方面的相關(guān)研究基礎(chǔ)更為薄弱。本研究綜述了當(dāng)前部分蘭花種子發(fā)育方面的研究進(jìn)展以及國蘭雜交育種概況，重點(diǎn)闡述了可能影響蘭花種子萌發(fā)的胚胎學(xué)機(jī)理，旨在為提高國蘭種間雜交種子萌發(fā)率以及國蘭雜交育種效率提供技術(shù)依據(jù)。

1 中國蘭花雜交育種概況

中國蘭花在我國有著悠久的栽培歷史，在長期的野外采集和栽培中出現(xiàn)了許多優(yōu)良的變異品種。近20年來，深受日本、韓國、臺(tái)灣蘭花市場的影響，國蘭的采挖、種植、銷售產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，選擇育種成為當(dāng)時(shí)國蘭育種的重要手段，雖然也選育出許多優(yōu)良的自然變異植株（品種），但卻導(dǎo)致國蘭自然資源掠奪性的采挖和珍貴種質(zhì)資源外流[4]，積極有效開展國蘭育種工作，推進(jìn)國蘭種質(zhì)資源創(chuàng)新就顯得迫在眉睫。吳漢珠等首次報(bào)道了中國蘭應(yīng)該綜合采用生物技術(shù)、核技術(shù)、雜交育種等多種途徑進(jìn)行育種，并相繼報(bào)道了49個(gè)雜交組合的種子萌發(fā)情況，其中包括了蘭屬內(nèi)地生種與地生種之間的雜交，培育出新品種10多個(gè)[5]，這是我國蘭花栽培歷史上一個(gè)新的起點(diǎn)。近年來，基因克隆[6-7]、體細(xì)胞快繁[8-10]、輻射誘變[11-12]、同工酶分析[13]、分子標(biāo)記[14-16]等技術(shù)手段已在國蘭育種及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中有所應(yīng)用，為提高國蘭育種效率提供了參考，但效果卻極為有限，開展國蘭種間以及品種間常規(guī)雜交育種仍然是國蘭育種中使用最為普遍、最重要的一種方法。

目前，中國蘭尤其是原生種，因?yàn)槠鋬?yōu)良的抗性、香味和觀賞特性已作為重要親本被廣泛應(yīng)用到大花蕙蘭等洋蘭的雜交育種中去[17-20]。近年來，雖然針對國蘭種間雜交育種的報(bào)道逐漸增多，而國蘭新品種的人工培育工作無論是從規(guī)模上，還是在研究進(jìn)展方面，基本處于剛剛開始探索階段，在種間遠(yuǎn)緣雜交方面更是缺乏系統(tǒng)研究。張志勝等開展了中國蘭花墨蘭和春蘭、建蘭和墨蘭、建蘭和寒蘭等種間雜交研究，發(fā)現(xiàn)不同雜交組合雜交種子萌發(fā)率存在較大差異，但并未深入研究其原因[17]；徐曉薇等開展了寒蘭和春蘭、寒蘭和墨蘭種間雜交研究，發(fā)現(xiàn)雜交易成功，但未對雜交種子的萌發(fā)開展深入研究[2]；李枝林等曾開展蕙蘭與墨蘭的種間雜交，但因數(shù)量較少，只開展了2朵花的雜交，并未得到雜交種子[21]。相對于洋蘭在品種改良方面取得的巨大成功，中國蘭的雜交育種工作進(jìn)展及商品化進(jìn)程則相當(dāng)緩慢，其中一個(gè)重要原因就是其雜交種子萌發(fā)難，雜種試管苗生產(chǎn)效率低[17]。國蘭雜交種子尤其是遠(yuǎn)緣雜交種子培養(yǎng)比洋蘭困難，種子萌發(fā)需時(shí)長，萌發(fā)率低。作為國蘭育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，種子的萌發(fā)直接關(guān)系到國蘭雜交育種的效率和成敗。因此，對國蘭雜交尤其是遠(yuǎn)緣雜交種子發(fā)育特性以及萌發(fā)機(jī)理開展深入研究，建立高效萌發(fā)體系尤為必要。

2 蘭花種子萌發(fā)研究現(xiàn)狀

2.1 蘭花種子的共生萌發(fā)

蘭花種子極其微小，種皮內(nèi)僅有1個(gè)發(fā)育不完全的胚，沒有胚乳和子葉，只有脂滴和少量蛋白質(zhì)，缺乏萌發(fā)過程中所需要的后備營養(yǎng)[22-24]，自然條件下萌發(fā)率極低。20 世紀(jì)初，法國的Bernard 和德國的Burgeff 就證實(shí)，只有感染了合適的真菌后，蘭科植物的種子才能在自然生態(tài)條件下萌發(fā)生長，隨著國內(nèi)外學(xué)者的深入研究，逐漸確立了蘭花種子與真菌菌根的共生體系[25]。目前，蘭花菌根已成為菌根研究中很重要的組成部分，眾多研究表明，蘭花菌根在促進(jìn)蘭花種子萌發(fā)及幼苗生長方面具有重要的生態(tài)作用。一是蘭花種子只有經(jīng)過真菌菌絲穿過種皮之后，通過胚胎細(xì)胞消化菌絲的方式才能萌發(fā)，在萌發(fā)的早期階段利用真菌分解原球莖中的貯存物，并向其提供有機(jī)和無機(jī)養(yǎng)分保證原球莖的生長發(fā)育[26-28]；二是雖然大部分蘭花在成苗后可獨(dú)立進(jìn)行光合作用，不需要真菌提供碳源，但是蘭花和真菌已形成共生體系，仍然會(huì)通過共生真菌吸收環(huán)境中的磷、磷、鉀等營養(yǎng)元素及水分[29-31]。目前，國外對于蘭花菌根研究較為深入，在真菌的分離、鑒定和篩選等方面也較為成熟，蘭花種子共生萌發(fā)技術(shù)已經(jīng)在許多蘭科植物中有所應(yīng)用，并取得較高的種子萌發(fā)率和成苗率[32-34]。國內(nèi)對于蘭花菌根研究則相對比較薄弱，主要集中在菌根真菌多樣性分析[35-36]和真菌的分離和鑒定[37-38]，對于共生萌發(fā)的研究則較少。楊友聯(lián)等采用從獨(dú)蒜蘭（Pleione bulbocodioides）分離的菌根真菌與其種子在燕麥培養(yǎng)基上共生萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)不同菌根真菌種有的能明顯促進(jìn)種子萌發(fā)，有的則會(huì)引起原球莖死亡[39]。范黎等研究發(fā)現(xiàn)，開唇蘭小菇（Mycena anoectochila）可與天麻（Gastrodia elata）種子共生，并顯著促進(jìn)其原球莖的生長[25]。雖然蘭花種子共生萌發(fā)技術(shù)對于促使幼苗根系菌根化、提高幼苗成活率具有重要意義，對于部分野生蘭花的保育具有重要價(jià)值，但蘭花與其共生真菌之間的關(guān)系十分復(fù)雜，許多問題諸如對真菌的專一性、真菌的侵入機(jī)制、蘭花與真菌共生系統(tǒng)調(diào)控、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等的了解仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，加之共生萌發(fā)技術(shù)的操作極為繁瑣，致使其在生產(chǎn)上的應(yīng)用十分有限，因此，非共生萌發(fā)技術(shù)在蘭花繁殖及育種研究中仍然占有非常重要的地位。

2.2 蘭花種子的非共生萌發(fā)

目前，國內(nèi)外對于蘭花種子非共生萌發(fā)的研究報(bào)道大多集中在對非共生培養(yǎng)體系中培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選[20，40-42]、對種子進(jìn)行預(yù)處理[43-45]等方面，用以提高種子的萌發(fā)率。但以上方法僅僅依靠改變種子萌發(fā)的外在環(huán)境，種子本身的發(fā)育特點(diǎn)是否直接影響種子萌發(fā)率還不得而知。許多研究發(fā)現(xiàn)，蘭花未成熟種子的萌發(fā)率要顯著高于成熟種子的萌發(fā)率。如杓蘭屬（Cypripedium）幾個(gè)種的成熟種子萌發(fā)遠(yuǎn)比未成熟種子困難[46-47]。Deb 等認(rèn)為紋瓣蘭[Cymbidium aloifolium （L.） Sw.]授粉后果莢的發(fā)育階段是其種子能否順利萌發(fā)的關(guān)鍵因素，同時(shí)發(fā)現(xiàn)授粉后9 個(gè)月的未成熟種子萌發(fā)效果最好，而大于11 個(gè)月的種子萌發(fā)出現(xiàn)畸形[48]。徐曉薇等研究了果齡對寒蘭雜交種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)雜交授粉后180～240 d 為寒蘭種子的最佳采收時(shí)間，早于180 d，種子萌發(fā)欠佳；晚于240 d，種子萌發(fā)率顯著下降[2]。以上研究均表明，蘭花種子在不同發(fā)育階段存在不同的萌發(fā)特性。有研究報(bào)道，蘭花種子發(fā)育過程中，蛋白及多糖含量發(fā)生了變化，胚柄細(xì)胞起著重要的調(diào)節(jié)作用[49-51]。此外，蘭花種子發(fā)育后期珠被細(xì)胞會(huì)發(fā)生角質(zhì)化也會(huì)影響種子萌發(fā)，Yamazaki等對金蘭（Cephalanthera falcata）人工授粉后50～120 d 的種子萌發(fā)及發(fā)育特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)授粉后70 d 的種子萌發(fā)率達(dá)到最高，時(shí)間越長萌發(fā)率越低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)種子發(fā)育后期（授粉后90 d），包圍胚胎的內(nèi)珠被開始積聚木質(zhì)素，并最終纖維化和角質(zhì)化，有可能會(huì)導(dǎo)致種子的休眠[41]。Lee等也發(fā)現(xiàn)臺(tái)灣杓蘭（Cypripedium formosanum）種子發(fā)育后期（授粉后135 d）萌發(fā)率極低，內(nèi)珠被同樣檢測到角質(zhì)化物質(zhì)，同時(shí)利用不同培養(yǎng)基配方和對種子進(jìn)行預(yù)處理等方法檢測種子萌發(fā)率，認(rèn)為種子的采收時(shí)間更能影響種子的萌發(fā)率[52]。

3 對國蘭雜交育種的啟示

國蘭種內(nèi)及種間雜交結(jié)實(shí)較容易，普遍可得到雜交果實(shí)，但種子萌發(fā)困難，國內(nèi)對于影響其萌發(fā)的機(jī)理研究報(bào)道較少，借鑒前人相關(guān)研究成果，我們得出如下設(shè)想：（1） 雜交種子發(fā)育是否正常？既然能結(jié)實(shí)說明可完成部分授粉受精，但是，因?yàn)榉N子極其微小，受精以后胚胎的發(fā)育是無法預(yù)知的，成熟種子的胚胎是否正常？正常種子比例是多少？種子活力如何？可開展深入研究。（2）如果胚胎發(fā)育異常，相關(guān)機(jī)理是什么？胚胎發(fā)育與其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化、營養(yǎng)物質(zhì)積累以及胚柄細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)都有緊密的聯(lián)系，具體哪個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常？還需要深入研究。（3）如果胚胎發(fā)育正常，是什么原因?qū)е铝朔N子萌發(fā)率低？可結(jié)合胚胎發(fā)育特性、檢測珠被細(xì)胞角質(zhì)化物質(zhì)積累以及培養(yǎng)基配方的影響等方面進(jìn)行探討。國蘭在我國有著悠久的栽培歷史，而且蘊(yùn)含濃厚的蘭文化，5種國蘭各具特色，如春蘭株型典雅；蕙蘭香氣濃郁，抗逆性強(qiáng)；墨蘭葉形漂亮，葉色變異豐富；建蘭可多季開花且花色花型變異豐富；寒蘭則株型修長，香味清醇。開展中國蘭種內(nèi)和種間遠(yuǎn)緣雜交育種具有非常重要的意義，如能明確影響其種子萌發(fā)的胚胎學(xué)機(jī)理，同時(shí)結(jié)合不同發(fā)育階段雜交種子在不同培養(yǎng)基配方的非共生萌發(fā)情況，揭示胚胎發(fā)育特性與種子萌發(fā)的關(guān)系，上述研究工作不僅將有助于我們從細(xì)胞水平上為建立國蘭雜交種子的高效萌發(fā)體系提供理論支持，而且可采取有效措施適時(shí)采收雜交種子、縮短國蘭育種周期促進(jìn)國蘭種質(zhì)資源創(chuàng)新，也可進(jìn)一步豐富國蘭生殖生物學(xué)資料，為國蘭其他相關(guān)研究提供重要的理論依據(jù)。

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