司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴對帕金森病模型大鼠結(jié)腸TH及nNOS表達(dá)的影響

畢樹立 高海英

1）河北唐山市開平醫(yī)院急診科 唐山 063021 2）河北唐山市豐南區(qū)醫(yī)院 唐山 063300

司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴對帕金森病模型大鼠結(jié)腸TH及nNOS表達(dá)的影響

畢樹立1）高海英2）

1）河北唐山市開平醫(yī)院急診科 唐山 063021 2）河北唐山市豐南區(qū)醫(yī)院 唐山 063300

目的 觀察司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴對帕金森病模型大鼠結(jié)腸中TH及nNOS表達(dá)的影響，探討司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴對帕金森病消化系統(tǒng)功能紊亂的可能機(jī)制。方法 72只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及聯(lián)合治療組，每組均設(shè)4d及8d2個(gè)時(shí)間點(diǎn)。采用頸背部皮下注射魚藤酮制備帕金森病模型大鼠，模型制備成功后，聯(lián)合治療組每日灌胃1次司來吉蘭0.5mg/kg及2次左旋多巴15mg/kg，直至試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。對照組及模型組每只每日均連續(xù)灌胃等體積生理鹽水至試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。應(yīng)用免疫組化法S-P法以及Western blotting檢測TH及nNOS在對照組、模型組以及聯(lián)合治療組大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 造模成功后，免疫組化及Western blotting結(jié)果均顯示，模型組大鼠結(jié)腸中的TH表達(dá)較對照組明顯減低（P＜0.05）；通過司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴治療后，聯(lián)合治療組TH表達(dá)顯著高于模型組，但仍低于對照組（P＜0.05），治療8d時(shí)較治療4d時(shí)，TH表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。nNOS在模型組中的表達(dá)較對照組以及聯(lián)合治療組明顯增多（P＜0.05），且聯(lián)合治療組中nNOS表達(dá)較對照組增多（P＜0.05），治療8d時(shí)較治療4d時(shí)，nNOS表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論 帕金森病大鼠結(jié)腸組織中的TH表達(dá)降低，而nNOS表達(dá)增加。司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴能緩解PD后TH的降低以及nNOS的升高，能有效緩解帕金森大鼠的腸道功能紊亂。

司來吉蘭；左旋多巴；酪氨酸羥化酶；nNOS；帕金森病；結(jié)腸

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是臨床常見的發(fā)生在中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。除了典型的運(yùn)動癥狀表現(xiàn)之外［1］，常伴有便秘等結(jié)腸功能紊亂。本研究以魚藤酮制作的帕金森病大鼠模型為對象，觀察司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴治療對帕金森病大鼠模型結(jié)腸中TH及nNOS表達(dá)的影響，探討司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴在帕金森患者結(jié)腸功能紊亂中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鹽酸司來吉蘭（Orion Corporation，芬蘭）；魚藤酮（北京博奧森生物工程有限公司，北京）；葵花油（唐山沃爾瑪超市，唐山）；兔抗大鼠TH抗體和兔抗大鼠nNOS抗體（cell signaling technology，美國）；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液購自（中杉生物有限公司，北京）；奧林巴斯BX63全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)（OLYMPUS，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 體質(zhì)量250～280g的健康雄性SD大鼠72只，按照隨機(jī)化原則將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為正常對照組（對照組）、帕金森病模型組（模型組）和司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴治療組（聯(lián)合治療組），各組再隨機(jī)分為模型制作成功后4d和8d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各12只。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 帕金森病模型的制備：采用頸背部皮下注射魚藤酮制備帕金森病模型。具體操作方法：魚藤酮應(yīng)用葵花油溶解配制成2mg/mL魚藤酮葵花油乳液，充分震蕩混勻后避光保存。PD組和聯(lián)合治療組大鼠稱重以后以魚藤酮2mg/kg體質(zhì)量計(jì)算魚藤酮葵花油乳液用量。捏起大鼠頸背部皮膚，用1mL注射器皮下注射魚藤酮葵花油乳液。以出現(xiàn)行為學(xué)改變作為判定模型成功的指標(biāo)［3］，選擇2～6分為實(shí)驗(yàn)大鼠。模型制備成功后，治療組：司來吉蘭（0.5mg/kg）灌胃1次/d，左旋多巴（15mg/kg）灌胃2次/d，分別連續(xù)給藥4d和8 d。對照組及PD組每只每日均連續(xù)灌胃等體積生理鹽水，直至試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。

1.3.2 標(biāo)本制備及檢測：腹腔注射10％水合氯醛溶液3 mL/kg麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠。滿意后用4％多聚甲醛灌流組織固定，剖腹后取大鼠結(jié)腸，清洗干凈后去除多余組織，取約3cm腸標(biāo)本多聚甲醛固定24h過夜行免疫組化檢測，另取約3cm腸標(biāo)本投入液氮，于-80°保存以備行Western blotting。免疫組化檢測：將結(jié)腸標(biāo)本制作成石蠟切片，采用免疫組化SP法，切片常規(guī)脫蠟脫水，3％H2O2溶液室溫作用封閉內(nèi)源性酶，微波進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加血清封閉，滴加適當(dāng)稀釋的兔抗大鼠一抗（TH、nNOS均為1∶200），濕盒孵育，4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，37℃恒溫箱孵育30min，蒸餾水洗滌后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡觀察。采用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件分析。每張切片在高倍鏡下觀察，陽性產(chǎn)物為棕黃色，以積分光密度（intensive optical density，IOD）為指標(biāo)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算5個(gè)高倍顯微鏡下平均光密度值。Western blotting蛋白印記：取各組制備好的大鼠結(jié)腸組織20μg，10％SDSPAGE電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜于封閉液中封閉，然后分別加入兔抗大鼠TH一抗（1∶500）、兔抗大鼠nNOS一抗（1∶1 000）孵育過夜。PBS洗膜，加人相應(yīng)濃度的二抗（羊抗兔，1∶2 000），室溫反應(yīng)1h，洗膜后ECL顯色，膠片曝光顯影后，使用Image J軟件進(jìn)行測定平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織TH及nNOS免疫組化檢測結(jié)果

聯(lián)合治療組大鼠結(jié)腸組織TH在各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)平均光密度明顯強(qiáng)于對照組及模型組（P＜0.05），模型組大鼠結(jié)腸組織TH各試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)平均光密度明顯強(qiáng)于對照組（P＜0.05）。模型組nNOS的平均光密度，較對照組明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴治療后，nNOS的平均光密度，較對照組明顯升高（P＜0.05），但較模型組明顯降低（P＜0.05）。聯(lián)合治療組TH及nNOS的平均光密度，第8天與第4天比較，無顯著性差異（P＞0.05）（見表1）。

表1 3組大鼠結(jié)腸組織中TH及nNOS平均光密度比較（±s）

表1 3組大鼠結(jié)腸組織中TH及nNOS平均光密度比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與對照組比較，P＜0.05；c與模型組比較，P＜0.05

組別TH nNOS 4d 8d 4d 8d對照組 172.52±5.86 170.43±4.22 80.45±3.62 82.35±4.43模型組 110.32±5.45a 109.28±5.26a 120.24±6.42a 124.04±5.28a聯(lián)合治療組 136.28±5.25b c 140.42±5.31bc 102.54±5.43b c 99.46±5.64b c

2.2 Western blotting蛋白印記檢測結(jié)果 模型組TH蛋白的表達(dá)，較對照組對應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)明顯降低（P＜0.05），經(jīng)司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴治療后，較模型組對應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)明顯升高，但較對照組對應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)仍低（P＜0.05），聯(lián)合治療組第8天與第4天比較，無顯著性差異（P＞0.05）。模型組nNOS蛋白的表達(dá)，較對照組對應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)明顯升高（P＜0.05），經(jīng)司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴治療后，較模型組對應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)明顯降低，但較對照組對應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)仍高（P＜0.05），聯(lián)合治療組第8天與第4天比較，無顯著差異（P＞0.05）（見表2）。

表2 3組大鼠結(jié)腸組織中TH及nNOS Western blotting表達(dá)比較（±s）

表2 3組大鼠結(jié)腸組織中TH及nNOS Western blotting表達(dá)比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與對照組比較，P＜0.05；c與模型組比較，P＜0.05

組別TH nNOS 4d 8d 4d 8d對照組6.42±0.48 6.50±0.45 0.35±0.04 0.37±0.02模型組 3.26±0.45b 3.05±0.48b 1.24±0.05b 1.26±0.04b聯(lián)合治療組 5.67±0.42ac 5.70±0.54a c 0.48±0.02a c 0.46±0.03a c

3 討論

帕金森?。≒D）是神經(jīng)退行性疾病，主要是腦內(nèi)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性而導(dǎo)致合成多巴胺能力下降，紋狀體缺乏多巴胺引起。其患者除臨床常見的典型運(yùn)動癥狀表現(xiàn)之外，常伴有便秘等結(jié)腸功能紊亂，PD患者結(jié)腸功能紊亂具體機(jī)制尚不清楚，可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)及腸神經(jīng)系統(tǒng)及其遞質(zhì)相關(guān)。

酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是催化去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類活性物質(zhì)生物合成的限速酶［4-5］，TH活性的升高或降低直接影響兒茶酚胺類活性物質(zhì)的合成，從而產(chǎn)生不同生物學(xué)效應(yīng)，影響機(jī)體的生理功能。結(jié)腸的排空受結(jié)腸移行運(yùn)動影響，帕金森病患者出現(xiàn)便秘等結(jié)腸功能紊亂時(shí)，其結(jié)腸巨大移行收縮波受到抑制，抑制胃腸道運(yùn)動的多巴胺作為抑制性遞質(zhì)在結(jié)腸排空運(yùn)動中起到重要作用。結(jié)腸交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放的去甲腎上腺素影響結(jié)腸平滑肌舒張功能，TH的升高或降低，直接影響去甲腎上腺素合成，從而影響結(jié)腸平滑肌的功能。本研究中，運(yùn)用魚藤酮制備帕金森病模型，發(fā)現(xiàn)TH在模型組中的表達(dá)明顯低于對照組，且在第4天及第8天時(shí)，無顯著差異（P＞0.05）。表明TH在魚藤酮制備帕金森病模型中合成減少，從而影響結(jié)腸兒茶酚胺類活性物質(zhì)的合成，進(jìn)而抑制胃腸道的運(yùn)動，從而導(dǎo)致便秘等。

一氧化氮（NO）為具有脂溶性的自由基性質(zhì)氣體，自被發(fā)現(xiàn)以來，因其兼有第二信使及神經(jīng)遞質(zhì)的作用而逐漸受到關(guān)注［6-7］。NO的合成與一氧化氮合酶（NOS）密切相關(guān)，目前已經(jīng)確定的NOS有三種，神經(jīng)元型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）及誘導(dǎo)型NOS（iNOS），其中nNOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要存在于小腦、嗅球、丘腦、海馬及大腦皮層，在正常生理情況下，多巴胺的釋放受NO的的調(diào)節(jié)，病理情況下，NO加劇多巴胺能神經(jīng)元的損傷。本研究通過檢測帕金森模型大鼠結(jié)腸中nNOS的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)帕金森模型組結(jié)腸組織中nNOS較對照組明顯增加（P＜0.05），表明神經(jīng)元的退行性變后能引起nNOS的表達(dá)增加，進(jìn)而NO表達(dá)增強(qiáng)，能加劇對神經(jīng)元損傷，從而發(fā)生便秘等結(jié)腸功能障礙。研究表明，神經(jīng)元的損傷能引起許多腦區(qū)的nNOS表達(dá)增加［8］。

司來吉蘭是一種不可逆性的單胺氧化酶抑制劑，能夠不可逆地抑制多巴胺降解為高香草酸，從而增加多巴胺的蓄積，從而改善多巴胺患者臨床癥狀［9］。帕金森模型大鼠經(jīng)司來吉蘭與左旋多巴治療后，大鼠結(jié)腸組織中，TH的含量較模型組增強(qiáng)，表明經(jīng)聯(lián)合治療后，能有效改善胃腸道運(yùn)動，進(jìn)而改善便秘的發(fā)生。模型組經(jīng)聯(lián)合治療后，nNOS的表達(dá)較模型組顯著降低，表明NO的生成減弱，從而對神經(jīng)元的損傷減輕，能改善便秘等結(jié)腸功能紊亂的發(fā)生。司來吉蘭聯(lián)合左旋多巴治療帕金森病大鼠，通過升高TH的表達(dá)及降低nNOS的表達(dá)而改善模型大鼠的結(jié)腸功能紊亂。但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

［1］Zou YM，Tan JP，Li N，et al.The Prevalence of Parkinson＇s disease ontinues to rise after 80years of age：a cross-sectional study of Chinese veterans［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（24）：3 908-3 915.

［2］陳忻，張楠，趙暉，等.魚藤酮致帕金森病大鼠行為學(xué)與黑質(zhì)病理損傷的關(guān)系［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2008，34（4）：232-234.

［3］樊志剛，喬蕾.酪氨酸羥化酶修飾人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植帕金森病大鼠紋狀體內(nèi)的多巴胺含量［J］.中國組織工程研究，2014，18（45）：7 285-7 289.

［4］肖春茍，沈偉哉，郭國慶，等.帕金森病模型大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)酪氨酸羥化酶免疫陽性神經(jīng)元的改變［J］.解剖學(xué)研究，2009，32（5）：321-324；329.

［5］邊寧，龔博君，郭軍，等.一氧化氮/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在動脈粥樣硬化過程中的作用［J］.中國病理生理雜志，2014，30（3）：414-418.

［6］段國賢，周開順，趙利軍，等.一氧化氮在大鼠肢體缺血/再灌注后腎組織細(xì)胞凋亡中的意義［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2009，25（2）：281-282；285.

［7］Saxon DW，Beitz AJ.Cerebellar injury induces NOS in Purkinje cells and cerebellar afferent neurons［J］.NeurorePort，1994，5（7）：809-812.

［8］Marconi S，Zwingers T.ComParative efficacy of selegiline versus rasagiline in the treatment of early Parkinson＇s disease［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（13）：1 879-1 882.

［9］Muller T，Hoffmann JA，DimPfel W，et al.Switch from selegiline to rasagiline is beneficial in Patients with Parkinson＇s disease［J］.J Neural Transm，2013，120（5）：761-765.

（收稿2014-10-11）

R-332

A

1673-5110（2015）10-0036-03

唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃，項(xiàng)目編號：13130292a