我國(guó)植物青枯菌遺傳多樣性研究進(jìn)展

黎妍妍，劉海龍，鄭 露，黃俊斌，李錫宏

(1．湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北武漢 430030;2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070)

植物細(xì)菌性青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的具有毀滅性的土傳病害。該病原菌廣泛分布于熱帶、亞熱帶和某些溫帶地區(qū)，能夠引起超過(guò)50科450多種植物青枯?。?－2］，其中包括許多經(jīng)濟(jì)作物如馬鈴薯、煙草、番茄、茄子、香蕉、花生等，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3］。

青枯菌不同的分離株在寄主范圍、地理分布、致病性、流行特征和生理生化等方面存在明顯的多態(tài)性。為了描述青枯菌的種內(nèi)變異性，各國(guó)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了種以下的分類(lèi)或分型的各種研究，提出了幾種分類(lèi)體系來(lái)鑒別青枯菌，以此來(lái)明確青枯菌的演化過(guò)程［4］。傳統(tǒng)的分類(lèi)體系是根據(jù)青枯菌的寄主范圍和對(duì)3種雙糖與3種己醇的氧化利用能力，將其劃分為不同的生理小種和生化型［5－6］。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，引入了分子生物技術(shù)對(duì)不同地理起源的青枯菌進(jìn)行劃分和鑒定。通過(guò)多方面的基因序列分析，對(duì)青枯菌種群內(nèi)的遺傳變異性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，在應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)明確青枯菌種群內(nèi)遺傳變異性的基礎(chǔ)上，將青枯菌定義為復(fù)合種［7－8］，并提出了一種新的分類(lèi)體系［9－10］。筆者綜述了我國(guó)植物青枯菌的危害、新的青枯菌寄主、青枯菌的分類(lèi)體系、遺傳多樣性等方面的研究進(jìn)展，旨在為我國(guó)青枯病的防控提供參考。

1 我國(guó)植物青枯病的危害現(xiàn)狀

1930年我國(guó)出現(xiàn)了青枯菌對(duì)花生的毀滅性危害，這是青枯菌危害我國(guó)植物的首次報(bào)道［6，11］，之后又在一些木本植物木麻黃［12－13］、桉樹(shù)［14－15］和桑樹(shù)［16］上發(fā)現(xiàn)了青枯病的危害。隨后該病迅速擴(kuò)展蔓延，如今已廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū)，成為最主要的植物病害之一。在我國(guó)，受侵染的植物主要包括煙草、馬鈴薯、番茄、花生、辣椒、茄子、甘薯、姜、木麻黃、油橄欖、桑等，其中尤以煙草和馬鈴薯受害最嚴(yán)重［1，17－19］。

目前，在我國(guó)有22個(gè)省(區(qū)、市)種植烤煙，而煙草青枯病在其中14個(gè)主要產(chǎn)煙區(qū)普遍發(fā)生，其中尤以福建、云南、貴州、廣西、湖南煙區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重，該病在某些年份常常暴發(fā)流行，給煙農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［20］。近年來(lái)，隨著全球氣候條件的改變，煙草青枯病的危害范圍已經(jīng)開(kāi)始由南向北擴(kuò)展，江西、山東、安徽、湖北、陜西等地已經(jīng)出現(xiàn)青枯菌危害煙草的報(bào)道，給我國(guó)煙草生產(chǎn)造成了巨大的威脅［21－27］。

我國(guó)馬鈴薯種植面積超過(guò)533．3萬(wàn)hm2，而每年因馬鈴薯青枯病造成的馬鈴薯產(chǎn)量損失為10%～15%，發(fā)病嚴(yán)重的地塊產(chǎn)量損失可達(dá)80%甚至絕產(chǎn)，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重威脅［28－30］。隨著我國(guó)馬鈴薯種植面積的不斷擴(kuò)大，馬鈴薯青枯病的發(fā)生也日趨嚴(yán)重。目前我國(guó)已有10個(gè)省(市)發(fā)生馬鈴薯青枯病，包括山東、福建、云南、湖南、四川、貴州、廣東、湖北、河北和北京，而且有不斷向北蔓延的趨勢(shì)［31］。

青枯菌對(duì)其他作物造成的危害也不容忽視。番茄青枯病是番茄生產(chǎn)上主要病害之一，在長(zhǎng)江以南各地尤其是華南地區(qū)發(fā)生較普遍［32－33］;桑青枯病在廣東個(gè)別地區(qū)發(fā)病率達(dá)80%;木麻黃青枯病使我國(guó)廣東沿海的一些林帶遭到毀滅，華南地區(qū)桉樹(shù)青枯病發(fā)生率達(dá)30% ～70%［34］;2009～2010年云南省西雙版納廣藿香種植區(qū)青枯病發(fā)病率達(dá)70%［35］。

2 我國(guó)新出現(xiàn)的青枯菌寄主

自1930年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)青枯病侵染花生［6，11］，至今已報(bào)道青枯菌在我國(guó)能夠侵染超過(guò)22科45種植物，而且還有新的寄主不斷出現(xiàn)。何自福等鑒定出青枯菌在廣東引起空心菜青枯?。?6］;王濤等報(bào)道了青枯菌引起羅漢果青枯病［37］;劉瓊光等鑒定出4種花卉美人蕉、姜花、黃穗和百日草青枯病是由青枯菌引起［38］，此后又發(fā)現(xiàn)了青枯菌能夠引起田間雜草涼粉草青枯病［39］;佘小曼等報(bào)道了2種新的病害廣藿香青枯病和勝紅薊青枯病均是由青枯菌引起［40－41］;李鵬等首次報(bào)道雪蓮果青枯病是由青枯菌引起［42］，并且用分離自雪蓮果上的青枯菌接種杜氏鼠尾草、曼陀羅和鴨趾草等田間雜草，證明該3種雜草是青枯菌的新的潛在寄主［35］。

3 青枯菌的分類(lèi)體系

主要根據(jù)青枯菌的致病性(寄主范圍)和生化特征(對(duì)碳源的利用能力)將其劃分為生理小種和生化型。目前，已報(bào)道青枯菌有 5 個(gè)生理小種［11，33，43－44］和 6 個(gè)生化型［5］。

青枯菌生理小種1號(hào)侵染寄主范圍最廣泛，能夠侵染煙草、番茄、花生、馬鈴薯等茄科植物以及涼粉草等田間雜草;生理小種2號(hào)主要侵染香蕉(麻口病)和海里康屬植物;生理小種3主要侵染馬鈴薯和番茄，偶爾侵染茄子;生理小種4主要侵染姜和勝紅薊;生理小種5主要侵染桑樹(shù)。根據(jù)青枯菌對(duì)3種雙糖(麥芽糖、乳糖和纖維二糖)和3種己醇(甘露醇、山梨醇和甜醇)的氧化利用能力，將其分為6個(gè)生化型(1、2A、2T、3、4、5)。在上述 2 個(gè)分類(lèi)體系中，只有生理小種3和生化型2具有對(duì)應(yīng)關(guān)系(R3Bv2)，并可通過(guò)特異性引物630-F/631-R 進(jìn)行 PCR 鑒定［9，31，45］。然而，作為傳統(tǒng)的青枯菌分類(lèi)體系，生理小種和生化型并不能有效地反映出病原菌在進(jìn)化及地理起源上的變異［31］。因此，還需更有效的分類(lèi)系統(tǒng)來(lái)詳細(xì)地評(píng)價(jià)青枯菌復(fù)合種的遺傳多樣性。

Fegan等提出了一個(gè)新的劃分體系，將青枯菌依次劃分為4個(gè)分類(lèi)水平:種、演化型、序列變種和克隆，并分別建立了與之相對(duì)應(yīng)的鑒定方法。演化型的劃分與地理起源緊密相關(guān)，即演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ［9］。其中，演化型Ⅰ菌株起源于亞洲;演化型Ⅱ菌株起源于美洲，但也在一些亞洲國(guó)家如中國(guó)、印度等發(fā)現(xiàn)該型青枯菌的存在;演化型Ⅲ菌株起源于非洲及其附近島嶼;演化型Ⅳ菌株起源于印度尼西亞，但在日本、澳大利亞、菲律賓等國(guó)家也報(bào)道了該型菌株的分布。利用青枯菌種特異性引物759/760，結(jié)合演化型特異性引物Nmult:21:1F、Nmult:21:2F、Nmult:23:AF、Nmult:22:InF 和 Nmult:22:RR(引物序列見(jiàn)表1)能夠在同一PCR反應(yīng)中同時(shí)鑒別出種和演化型，稱(chēng)之為演化型復(fù)合PCR(Pmx-PCR)。通過(guò)演化型復(fù)合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小能夠確定演化型的分類(lèi)歸屬。演化型Ⅰ產(chǎn)生280和144 bp的條帶;演化型Ⅱ產(chǎn)生280和372 bp的條帶;演化型Ⅲ產(chǎn)生280和91 bp的條帶;演化型Ⅳ產(chǎn)生280和213 bp的條帶。

青枯菌每一個(gè)演化型通過(guò)內(nèi)切葡聚糖酶(egl)基因部分序列和基因組指紋圖譜法(rep-PCR)又可進(jìn)一步劃分為序列變種和克?。?，31，46］，目前青枯菌已經(jīng)劃分出 53 個(gè)序列變種(圖1)。隨著對(duì)青枯菌研究的不斷深入，可能會(huì)有新的序列變種出現(xiàn)。除了演化型和序列變種外，多位點(diǎn)序列分型(MLSA)也已被用于青枯菌種內(nèi)遺傳多樣性的研究［46－50］，Almeida等建立了青枯菌、丁香假單胞桿菌和黃單胞桿菌的MLSA/MLST 的數(shù)據(jù)庫(kù)［51］。

4 我國(guó)植物青枯菌遺傳多樣性

植物青枯病菌具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，不同地理起源的青枯菌在與寄主協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的生理分化和高度的變異性。

對(duì)危害我國(guó)的植物青枯菌研究結(jié)果表明，分布在我國(guó)的青枯菌有生理小種1、3和4號(hào)，生化型2、3、4和5(表2)。根據(jù)Fegan等［9］提出的青枯菌分類(lèi)系統(tǒng)，可將我國(guó)青枯菌分為演化型Ⅰ和Ⅱ，其中演化型Ⅰ包括10個(gè)序列變種，演化型Ⅱ包括2 個(gè)序列變種［11，31，41，50，52－53］，到目前為止在我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)演化型Ⅲ和Ⅳ型菌株。

寄生于我國(guó)大多數(shù)植物上的青枯菌屬于演化型Ⅰ，只有來(lái)自于馬鈴薯上的部分菌株以及1個(gè)分離自茄子和2個(gè)分離自木麻黃上的菌株屬于演化型Ⅱ［29］。另外，分離自臺(tái)灣番茄上的1株青枯菌也屬于演化型Ⅱ。采用BOX-PCR指紋圖譜分析法對(duì)來(lái)源于我國(guó)的15個(gè)省、14種寄主上的319個(gè)青枯菌菌株進(jìn)行多樣性分析，在相似系數(shù)為75%時(shí)將其分為29 個(gè)不同的類(lèi)群［53］。

4．1 我國(guó)煙草青枯菌多樣性 我國(guó)煙草青枯菌屬于生理小種1號(hào)，生化型3或4，演化型Ⅰ以及4個(gè)序列變種(15、17、34和 44)［2，21－27，31，54］。其中煙草青枯菌生化型 3 分布于所有 14個(gè)產(chǎn)煙區(qū)，而生化型4僅分布于福建和廣西煙區(qū)。潘哲超等對(duì)福建、廣東、廣西和貴州煙區(qū)煙草青枯病序列變種進(jìn)行鑒定，序列變種15和44分布于廣西和福建，序列變種17分布在廣東、廣西、福建和貴州，序列變種34僅存在于福建［31，54］。周訓(xùn)軍等采用MLSA研究方法對(duì)我國(guó)11個(gè)主要產(chǎn)煙區(qū)的93株煙草青枯菌進(jìn)行種內(nèi)遺傳多樣性分析，93個(gè)菌株被分為51個(gè)序列型(ST)，并運(yùn)用eBURST-V3軟件共享5/7基因標(biāo)準(zhǔn)將所有供試菌株分為4個(gè)亞群和4個(gè)單一群［49］。上述結(jié)果揭示了雖然我國(guó)煙草青枯菌地理分布廣泛，具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，但煙草青枯菌的組群劃分與菌株的地理區(qū)域和煙草品種無(wú)明顯相關(guān)性。

表1 用于多重PCR、egl基因和mutS基因擴(kuò)增的引物序列

4．2 我國(guó)馬鈴薯青枯菌多樣性 我國(guó)馬鈴薯青枯菌菌株屬于2個(gè)生理小種(小種1和小種3)，3個(gè)生化型(2、3和4)和2個(gè)演化型(Ⅰ和Ⅱ)。其中生理小種3(生化型2和演化型Ⅱ)是優(yōu)勢(shì)小種，在10個(gè)省(區(qū))均有分布;生理小種1(生化型3或4，演化型Ⅰ)只在山東、湖南、湖北和四川有發(fā)現(xiàn)［31］。我國(guó)馬鈴薯青枯菌演化型Ⅰ和演化型Ⅱ還可以進(jìn)一步分為不同的序列變種，其中演化型Ⅰ包括序列變種13、17和18，而演化型Ⅱ包括序列變種 1［29，31，50，52，55］。

目前在我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)演化型Ⅳ侵染馬鈴薯，但是在菲律賓、日本、印度、澳大利亞等亞洲國(guó)家已報(bào)道引起馬鈴薯青枯病的青枯菌屬于演化型Ⅳ［56－57］，而且該型菌株對(duì)馬鈴薯具有很強(qiáng)的致病力，可能會(huì)成為我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)上的潛在威脅，因此，我國(guó)需要通過(guò)加強(qiáng)海關(guān)檢疫等來(lái)防止演化型Ⅳ青枯菌侵入我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)。

5 植物青枯病防治

由于青枯菌具有廣泛的寄主、獨(dú)特的致病機(jī)理以及極強(qiáng)的變異能力，青枯病的防治一直是植物病害防治的難題。盡管各國(guó)學(xué)者一直在從事相關(guān)方面的研究，并且在各領(lǐng)域中的研究結(jié)果對(duì)青枯病的防治取得一定成效，但是仍有很多問(wèn)題需要解決。人們難以用1種方法從根本上解決青枯病的防治問(wèn)題，只能多種防治方法相結(jié)合，盡量減輕青枯病的危害。

表2 我國(guó)青枯菌菌株復(fù)合群的演化型、序列變種、寄主、地理來(lái)源、生理小種和生化型

5．1 農(nóng)業(yè)防治 實(shí)行合理輪作、高壟栽培，及時(shí)清理田間雜草和病株;選育、推廣抗青枯病的品種［18，33］以及抗病砧木嫁接［58］是防治茄科植物青枯病最理想的方法，抗病品種的選育和利用要根據(jù)病菌的致病型因地制宜，做好抗病品種的合理布局，避免品種單一化。然而由于林木發(fā)達(dá)的維管系統(tǒng)以及多年生特征，上述方法對(duì)林木青枯病的防治是行不通的或難以實(shí)現(xiàn)的［34］。

5．2 化學(xué)防治 盡管化學(xué)防治有誘導(dǎo)抗性、無(wú)選擇滅殺天敵、環(huán)境污染等諸多缺點(diǎn)，但在植物病害的實(shí)際防治中還是起著重要作用。目前，我國(guó)對(duì)于青枯病的防治主要依靠化學(xué)藥劑?；瘜W(xué)藥劑防治主要圍繞農(nóng)作物展開(kāi)，農(nóng)用硫酸鏈霉素［59］、青枯靈、青萎散［60－61］、康地蕾得［62］等在煙草、番茄等農(nóng)作物青枯病的防治中都有一定效果，但在林木青枯病防治中應(yīng)用較少。對(duì)林地土壤進(jìn)行消毒是林木青枯病防治中比較實(shí)用有效、容易操作的處理措施，多數(shù)是對(duì)拔除病株的根坑部土壤進(jìn)行消毒，能有效防止青枯病的蔓延與擴(kuò)散，20%石灰水、石灰粉、福爾馬林溶液、高錳酸鉀等都可用于土壤消毒，其中石灰水和石灰粉是實(shí)際生產(chǎn)中較常用的藥劑［15］。

5．3 生物防治 青枯病的生物防治是對(duì)環(huán)境友好的防治方法，越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。目前，對(duì)青枯病有良好防效的微生物主要有無(wú)致病力青枯菌、假單胞菌、芽孢桿菌、益生真菌等。董春等研究表明，自發(fā)突變的無(wú)致病力番茄青枯菌株Tm3對(duì)番茄青枯菌Tm46具有較強(qiáng)的抑菌作用，且能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)［63］;王羽等從番茄青枯病苗中分離出198株無(wú)致病力青枯菌，其中2株在溫室防治試驗(yàn)中對(duì)番茄青枯病起到較好的防治效果，20 d后防效分別為43%和47%［64］;彭細(xì)橋等從煙株中分離了32株拮抗細(xì)菌，其中3個(gè)菌株對(duì)青枯菌具有強(qiáng)的拮抗作用且有較好的內(nèi)生性和定殖力，經(jīng)鑒定1株為枯草芽孢桿菌，2株為短芽孢桿菌［65］;朱紅惠等發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌(AM)對(duì)番茄青枯菌有抑制作用［66］;弓明欽等研究發(fā)現(xiàn)在有AM菌存在的情況下，桉樹(shù)幼苗不發(fā)青枯病或發(fā)病較輕［67］。

6 結(jié)語(yǔ)

青枯菌在世界范圍內(nèi)分布廣泛，引起多種植物青枯病，在現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上，還需要繼續(xù)對(duì)其研究，為青枯病檢測(cè)和防治尋找最佳著力點(diǎn)。從我國(guó)青枯病的發(fā)生情況來(lái)看，盡管青枯病主要在長(zhǎng)江以南地區(qū)發(fā)生普遍，但隨著氣候條件的變化以及南北地區(qū)貿(mào)易的日益緊密，青枯病的發(fā)生已有由南向北擴(kuò)展的趨勢(shì)，因此需要采取有效措施防止青枯病繼續(xù)擴(kuò)展危害。對(duì)于青枯病的防治，無(wú)論采取哪一種單一的防治方法都很難奏效，只有將抗病品種利用、各項(xiàng)農(nóng)業(yè)措施、化學(xué)藥劑以及生物防治等防治方法相結(jié)合，才能將青枯病的危害降低到最低限度。

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