低胰蛋白酶抑制劑全豆豆?jié){的研制

霍建冶，王建光，吳超義，錢 和，成玉梁(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

不排豆渣的全豆豆?jié){是利用超微粉碎技術(shù)實現(xiàn)大豆營養(yǎng)全利用的豆?jié){，口感細膩，富含大豆蛋白、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)。大豆蛋白是一種理想的植物蛋白，氨基酸種類齊全，其中人體所必需的8種氨基酸的含量基本上與聯(lián)合國衛(wèi)生組織所建議的相近［1］。但是，大豆蛋白中有抗營養(yǎng)因子胰蛋白酶抑制劑［2］。胰蛋白酶抑制劑對人體的危害主要表現(xiàn)在抑制人體胰蛋白酶活性，食用未完全除去胰蛋白酶抑制劑的豆制品時，不僅會抑制人體對蛋白質(zhì)的消化吸收，還會引起胰腺腫大等中毒癥狀［3］。研究表明，當大豆中的胰蛋白酶抑制劑含量降低90%以上時才被認為可放心食用。主要的去除方法包括物理處理法、化學處理法和生物處理法等。其中物理法鈍化是研究最廣泛的，而熱失活是常用的鈍化大豆胰蛋白酶抑制劑的方法。但過度加熱將導致大豆中某些氨基酸，尤其是賴氨酸、精氨酸和色氨酸等堿性氨基酸利用率下降［4］?；瘜W處理方法主要有尿素處理、乙醇處理等。操作方便，但有化學物質(zhì)殘留，應(yīng)用較少。生物學方法主要有酶制劑處理法、微生物發(fā)酵法、發(fā)芽處理法等。大豆胰蛋白酶抑制劑可以被蛋白酶水解，改變活性中心而失活［5］。應(yīng)用酶法消除大豆蛋白中的胰蛋白酶抑制劑具有效率高，保護營養(yǎng)成分，安全無殘留等優(yōu)點。筆者創(chuàng)新性地在打漿階段加入中性蛋白酶，研究其對胰蛋白酶抑制劑的鈍化效果，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑。東北大豆;中性蛋白酶(活力大于1 600 AZO/g);牛胰蛋白酶;氫氧化鈉;甲醛溶液;苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺鹽酸鹽(BAPA);Tris;氯化鈣;鹽酸溶液;冰醋酸;β-環(huán)糊精。

1.1.2 主要設(shè)備。打漿機，膠體磨，恒溫磁力攪拌器，高壓均質(zhì)機，激光粒度分析儀，分光光度計，水浴鍋。

1.2 試驗方法

1.2.1 全豆豆?jié){制備方法。大豆除殘、除雜、清洗后，按1∶3的豆水質(zhì)量比于4℃下浸泡18 h。將浸泡完全的大豆瀝干，置于沸騰的0.5%(W/V)的NaHCO3溶液中進行熱燙處理6 min。

將熱燙后的濕豆沖洗至中性后和一定溫度去離子水按一定比例混合，加入一定量的中性蛋白酶，打漿機粗粉碎2 min后靜置讓蛋白酶充分反應(yīng)。酶解片刻后迅速將豆?jié){加熱至80℃保溫10 min滅酶。

滅酶后的豆?jié){使用膠體磨粉碎1 min，然后使用高壓均質(zhì)機進一步細化豆?jié){，最終得到口感細膩的全豆豆?jié){。

1.2.2 胰蛋白酶抑制劑含量的測定。將樣品稀釋，使其產(chǎn)生40%～60%的抑制百分率。分別加溶液于下面4個10 ml具塞玻璃離心管中:(a)標準空白。5 ml BAPA溶液，3 ml去離子水，1 ml 5.3 mol/L醋酸。(b)標準溶液。5 ml BAPA溶液，3 ml去離子水。(c)樣品空白。5 ml BAPA溶液，1 ml樣品稀釋液，2 ml去離子水，1 ml 5.3 mol/L醋酸。(d)樣品溶液。5 ml BAPA溶液，1 ml樣品稀釋液，2 ml去離子水。將各離心管充分混勻后置于37℃恒溫水浴鍋中溫育10 min。然后各離心管均加入1 ml胰蛋白酶工作液，混勻，繼續(xù)溫育10 min±5 s后于(b)管和(d)管中分別加入1 ml 5.3 mol/L醋酸終止反應(yīng)。充分混合上述溶液，用分光光度計在410 nm用10 mm比色皿測定溶液吸光度(用標準空白調(diào)零)。該溶液能夠保持穩(wěn)定至少2 h［6］。

結(jié)果計算:

①胰蛋白酶抑制百分率。公式如下:

式中，I為胰蛋白酶抑制百分率;Ar為標準溶液的吸光度;As為樣品溶液的吸光度;Abs為樣品空白吸光度。

②胰蛋白酶抑制劑活性。只有樣品提取液胰蛋白酶抑制百分率在40%～60%范圍內(nèi)時，樣品溶液吸光度可用于胰蛋白酶抑制劑活性計算。計算胰蛋白酶抑制劑活性，用每克樣品抑制的胰蛋白酶毫克數(shù)表示，結(jié)果精確至0.1 mg/g。

式中，TIA為胰蛋白酶抑制劑活性(mg/g);AI=Ar－(As－Abs)為吸光度變化值;V是樣品提取液體積(ml);m是測試樣品的質(zhì)量(g);0.019是1 μg純牛胰蛋白酶在410 nm波長的吸光度;D是樣品的稀釋倍數(shù)。

③胰蛋白酶抑制劑鈍化率的計算。計算公式:

式中，TIA0為根據(jù)未處理大豆折算的豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑活性，TIA1為酶解后豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑。

1.2.3 豆?jié){水解度的測定。取水解滅酶后5.0 ml酶解液，置于200 ml燒杯中，加入60 ml無CO2水，開動磁力攪拌器，加少量堿液調(diào)節(jié)pH為8.20，再加入10 ml中性甲醛溶液，用0.5 mol/L NaOH標準溶液調(diào)節(jié)體系pH至9.20，記錄消耗NaOH標準溶液體積為V(ml)。同時取未酶解相同濃度蛋白質(zhì)溶液5.0 ml，按上述方法作空白試驗，記錄消耗NaOH標準溶液體積為V0(ml)。

式中，C為 NaOH標準溶液濃度(mol/L);V為酶解液消耗NaOH標準溶液體積(ml);V0為空白液消耗NaOH標準溶液體積(ml);0.014為氮毫克當量;N為底物樣品總氮含量(g)。

1.2.4 酶法鈍化胰蛋白酶抑制劑的單因素試驗。分別考察打漿豆水比:1∶5～1∶9、打漿溫度:30～70℃、蛋白酶添加量:0～20 μl/g、酶解時間:0～30 min對豆?jié){水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響。

1.2.5 酶法鈍化胰蛋白酶抑制劑條件的正交試驗優(yōu)化。采用正交試驗對酶解條件進行優(yōu)化，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，研究豆水比、打漿溫度、加酶量和酶解時間4個因素對試驗結(jié)果的影響。通過單因素試驗確定4個因素的取值水平范圍，以胰蛋白酶抑制劑鈍化率為指標，以確定最佳水解條件組合。正交試驗組合見表1。

1.2.6 豆?jié){脫苦效果的感官評定。向酶解完成后的豆?jié){中加入不同質(zhì)量的β-環(huán)糊精，80℃下保溫10 min，經(jīng)過超微粉碎后由10名感官評定員進行評定。表2為感官評定標準。

2 結(jié)果與分級

2.1 打漿豆水比對豆?jié){水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響 打漿時的豆水比影響著底物濃度，豆水比太低，底物濃度低，酶與底物接觸的幾率小，水解度低。豆水比過高，底物濃度高，蛋白質(zhì)分子會通過疏水作用和二硫鍵作用，形成網(wǎng)狀聚合體，降低酶解效率［7］。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

表2 感官評分標準

豆水比分別為 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9，加酶量為 6 μl/g蛋白，打漿溫度50℃，酶解15 min，結(jié)果如圖1、圖2所示，胰蛋白酶抑制劑(TI)的鈍化率與水解度呈正相關(guān)趨勢。當豆水比1∶7時，豆?jié){水解度和TI鈍化率最高。

圖1 豆水比對豆?jié){水解度的影響

圖2 豆水比對胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響

2.2 打漿溫度對豆?jié){水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響 保持豆水比1∶7，加酶量為6 μl/g蛋白酶解時間15 min時，研究不同的打漿溫度對水解度和TI鈍化率的影響。如圖3、圖4所示，打漿溫度從30℃提高到50℃，酶解反應(yīng)速度相應(yīng)提高，但是打漿溫度超過50℃后，水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率降低。

圖3 打漿溫度對豆?jié){水解度的影響

打漿過程為升溫過程，打漿結(jié)束后豆?jié){的終溫會影響蛋白酶分子穩(wěn)定性，這是因為蛋白酶分子的肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，如果反應(yīng)溫度過高，會引起次級鍵解離，從而使蛋白酶喪失或部分喪失催化活性;但是若反應(yīng)溫度過低，則會大大降低體系內(nèi)分子運動的激烈程度，從而降低蛋白酶與底物的碰撞機率［8］。

圖4 打漿溫度對胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響

2.3 蛋白酶添加量對豆?jié){水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響 保持豆水比1∶7，打漿溫度50℃，蛋白酶解時間15 min時，考察中性蛋白酶添加量對水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響，結(jié)果如圖5、圖6所示。當添加量大于14 μl/g蛋白時，水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率變化平緩。

隨著中性蛋白酶用量增加，酶的催化位點與蛋白分子相應(yīng)位點接觸幾率增多，水解度升高。當這些位點快全部斷裂時，即使繼續(xù)加入蛋白酶，肽鍵都難以再斷裂。

圖5 中性蛋白酶添加量對豆?jié){水解度的影響

2.4 酶解時間對豆?jié){水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響 保持豆水比1∶7，打漿溫度50℃，添加6 μl/g蛋白的中性蛋白酶，考察水解時間對豆?jié){水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率變化的影響，結(jié)果如圖7、圖8所示。15 min內(nèi)水解度和胰蛋白酶抑制劑迅速上升，20 min后水解度和胰蛋白酶抑制劑鈍化率的變化趨勢平緩。

圖6 中性蛋白酶添加量對胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響

圖7 酶解時間對豆?jié){水解度的影響

圖8 酶解時間對胰蛋白酶抑制劑鈍化率的影響

2.5 胰蛋白酶抑制劑鈍化條件的優(yōu)化 該試驗采用L9(34)的正交表設(shè)計，正交試驗結(jié)果和極差分析見表2。用SPSS軟件對結(jié)果進行分析處理，建立鈍化率與因素的數(shù)學模型，以胰蛋白酶抑制劑鈍化率為指標，通過對模型分析獲得最佳工藝條件。由表2可知，影響鈍化率的主次關(guān)系為:豆水比＞水解溫度＞酶用量＞酶解時間。最佳組合為豆水比1∶7、水解溫度50℃、酶用量16 μl/g、酶解時間20 min，在此基礎(chǔ)上進行驗證試驗，胰蛋白酶抑制劑鈍化率為90.5%，符合要求。

2.6 酶解后豆?jié){的脫苦 結(jié)果如表3所示，當添加3.0%的β-環(huán)糊精時，感官評分最高。當?shù)鞍踪|(zhì)水解時，隨著肽鏈解離，可呈現(xiàn)苦味的疏水性氨基酸殘基或其形成小肽游離出來，產(chǎn)生苦味［9］。β-環(huán)狀糊精是由7個葡萄糖分子連接成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物，主體構(gòu)型像個中間有空洞，兩端不封閉的筒［10］。圓筒上部的廣口排列著12個C2，C3的羥基，底部狹窄處有6個C6羥基。因而從整體上看環(huán)糊精是親水的，但是由于環(huán)的內(nèi)側(cè)被C-H所覆蓋，與外側(cè)相比有較強的疏水性。當溶液中同時存在親水和疏水性物質(zhì)時，疏水物質(zhì)則被環(huán)內(nèi)疏水基團吸附而形成包含化合物。對于疏水性多肽來說，該機理的實際效果則是對苦味起到“包埋”作用［11］。另外，β-環(huán)狀糊精本身也帶有淡淡的甜味［12］。

表2 正交結(jié)果分析

表3 β-環(huán)糊精用量對豆?jié){感官評定的影響

3 結(jié)論

該研究給出了一種利用濕法超微粉碎技術(shù)，并在打漿時添加中性蛋白酶來生產(chǎn)低胰蛋白酶抑制劑的全豆豆?jié){的方法，為其工業(yè)化大生產(chǎn)提供了參考。試驗結(jié)果表明，豆?jié){的胰蛋白酶抑制劑鈍化率和水解度呈正相關(guān)趨勢，苦味也會隨著水解度的提高而提高。豆水比1∶7，打漿溫度50℃，加入16 μl/g蛋白質(zhì)的中性蛋白酶，酶解20 min后滅活，可鈍化90%以上的胰蛋白酶抑制劑。添加3.0%的β-環(huán)糊精可以完全掩蔽酶解后豆?jié){的苦味。

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