代謝組學方法研究進展

紀 勇，郭盛磊，楊玉煥*

(1.東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040 2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱150040)

代謝組學是系統(tǒng)生物學的重要組成部分，是通過觀察生物體系(細胞、組織或生物個體)受外部刺激(如外部環(huán)境因素的變化或某些疾病的出現(xiàn))后其代謝路徑以及相應代謝產物與非刺激條件下的變化區(qū)別研究生物體系的一門科學。代謝組學主要研究相對分子量小于1 000 Da的內源性小分子物質。1999年，Nicholson等［1］首次提出代謝組學的概念，使用“Metabonomics”一詞，通過對核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)的生物數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析來闡釋病理以及生理上的刺激對生物體代謝產生的變化。2000年，F(xiàn)iehn等［2］提出“Metabolomics”的概念，認為代謝組學主要進行代謝物靶標分析、代謝輪廓分析、代謝物定性定量分析、代謝指紋分析4個層次的分析。

代謝組學作為一種研究手段，主要具有如下優(yōu)點:①代謝組學反映生物體在各個因素綜合作用下的終末效應，是這些效應的綜合體現(xiàn)，具有很強的綜合信息優(yōu)勢;②其代謝物種類遠小于所對應的基因和蛋白質數(shù)目，研究相對簡單;③基因和蛋白質表達的微小變化會在代謝物水平上得到放大，因此更容易檢測;④很多內源性小分子化合物的生化代謝途徑已較清楚;⑤許多代謝產物已作為疾病的特異性標志物用于臨床診斷。代謝組學的試驗流程通常包括以下階段:①前期試驗方案設計;②樣品的前處理;③儀器進樣分析;④數(shù)據(jù)處理與分析;⑤闡釋相關生物學意義。

1 前期試驗方案設計

在進行樣品前處理之前大都要擬定相關的試驗方案。通過明確試驗的研究內容、目的、意義來優(yōu)化前期的樣品處理。根據(jù)樣品物種來源(如植物、動物、微生物等)，需要找到樣品前處理的最優(yōu)方法。例如，在設計人源樣本的相關試驗時，需考慮樣本之間的差異因素(如年齡、性別、身體狀況、接觸的外部環(huán)境等)［3］以及相同因素樣本的數(shù)量［4］，使得樣本(即試驗樣本與對照樣本)之間具有可對比性。在設計植物樣本前處理時，應將植物組織中的細胞壁充分破碎。同時，細胞內的代謝成分不被破壞。Ducruix等［5］使用Tris和甲醇(含有秋水仙素和腎上腺皮質激素)提取液超聲萃取擬南芥的細胞的代謝產物，在破壞細胞壁結構的同時，又能有效地提取相應的代謝產物。另外，根據(jù)試驗樣本基質不同(如尿液、血漿、細胞、組織等)，在前處理時需要考慮不同樣本之間不同的前處理方法，達到最優(yōu)的試驗預期效果［6］。

2 樣品前處理

樣品前處理旨在最大限度地將樣本中的雜質(如一些蛋白質、糖類、脂肪等)除去，同時能較完整地保留樣品中的整體代謝產物或特異性的目標代謝產物。目前，代謝組學研究最廣泛的是其在臨床上的應用。因此，在處理人的尿液、血漿、細胞、組織過程中會有多種提取方法，如處理尿液、血漿一般采用液液萃取法，而細胞、組織則多采用超聲破碎提取。

由于液液萃取，不能最大限度地除去樣品雜質，保留樣本中的相關代謝物。近些年來，固相萃取(Solid phase extraction，SPE)相關技術的出現(xiàn)能更好地去除樣品中的雜質，保留樣品中的代謝物。Chetwynd等［7］使用SPE來分析人類尿液，在尿液中鑒定出24種代謝產物。使用SPE能更好地降低基質效應，從而提高檢測靈敏度。

王亞平［8］在尿液樣品前處理時對直接進樣分析、液液萃取、沉淀蛋白、固相萃取(SPE)4種前處理方法進行對比試驗。結果表明，沉淀蛋白和直接分析方法處理后得到的樣品中尿素濃度過高，離子抑制現(xiàn)象較明顯，甚至超過色譜柱容量，導致重現(xiàn)性不好;乙酸乙酯等有機試劑的萃取方法能夠檢測到極性小的I相代謝產物，極性大的II相代謝產物則會丟失;而SPE法能夠同時檢測I和II相代謝產物，且離子抑制現(xiàn)象不明顯。綜上所述，SPE法是研究代謝組學較理想的前處理方法。

3 儀器進樣分析

目前，代謝組學主要有液相與質譜聯(lián)用技術(LC-MS)、氣相與質譜聯(lián)用技術(GC-MS)、核磁共振技術(NMR)3種分析平臺。Web of Science的數(shù)據(jù)顯示，LC-MS是目前最主要的代謝組學分析平臺，其次為NMR，GC-MS使用相對較少。3種分析平臺的特點、局限性見表1。3.1 LC-MS 由于目前代謝組學的研究大多集中在臨床醫(yī)學、藥理分析領域，而其試驗樣本大多為人體尿液、血漿、細胞、組織等，這些樣本中的代謝物大都能較好地電離。另外，LC-MS靈敏度較高，檢測限為ppb(即十億分之一)，可用于痕量分析。根據(jù)液相的柱效，可分為HPLC(高效液相色譜)和U(H)PLC(超高效液相色譜)。以Waters公司的ACQUITY UPLC?系統(tǒng)為例，其分析樣本所需時間為HPLC的1/3，靈敏度提高了4倍，分離度提高了2倍;使用試劑節(jié)省95%。有研究表明，當用UPLC-MS和HPLC-MS分析同樣的大鼠尿液時，前者的靈敏度、峰響應值以及分離的物質種類均優(yōu)于后者，且前者的分析時間較后者大大縮短，更適用于高通量樣品分析［9］。而且，在代謝組學樣品分析過程中，可使用填料不同的色譜柱(如 C18，Amid，HILIC，T3，Phenyl等)，能更全面地分析樣本中代謝物的差異，從而更方便地找到潛在的生物標記物。

表1 代謝組學3種主要分析平臺對比

根據(jù)電離方式不同，可分為電噴霧離子源(Electron spray ionization，ESI)和大氣壓化學電離源(Atmospheric pressure chemical ionization，APCI)2種工作方式的質譜。ESI可同時分析揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝產物，適用于離子型以及極性化合物的鑒定分析。它靈敏度較高，能分析大分子量的化合物(分子量大于1 000 Da)。APCI相較于ESI基質效應小，且受流動相緩沖鹽影響較小。APCI主要分析非極性以及小分子的化合物(相對于用ESI電離的化合物而言)。因此，在代謝組學的研究過程中，可同時使用不同的電離源，使得樣品中的代謝產物更全面［10］。

根據(jù)質量分析器工作原理，質譜主要可分為三重四極桿(Triple quadrupole，TQD)、飛行時間(Time of flight，TOF)、傅里葉變換離子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，F(xiàn)TICR)以及離子阱(Ion trap)。其中，三重四級桿質譜由于其重現(xiàn)性較好主要用于醫(yī)藥、食品安全、大氣環(huán)境科學等領域的定量分析，因此它可分析代謝組學中已知的某些特定的代謝產物在體內代謝含量的變化［11］;而后3種一般被稱為高分辨質譜，主要用于代謝組學中的定性分析。

近年來，飛行時間質譜(TOF)與超高效液相色譜(UPLC)串聯(lián)即UPLC-TOF，能更快速、更精確地分析代謝產物。Shi等［12］研究患有阿爾茨海默癥SD大鼠的腦組織樣本，使用UPLC-TOF對樣本進行了分析，發(fā)現(xiàn)酪氨酸、精氨酸、谷氨酰半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、?；撬岬?0種潛在的生物標記物。

3.2 GC-MS 由于GC-MS在分析樣品時需要進行衍生化處理以及只能分析易揮發(fā)且較穩(wěn)定的物質，GC-MS的應用受到了較大的限制［13］。目前，GC-MS在代謝組學的研究中大多作為靶向性物質的分析，亦或作為非靶向性代謝組學LCMS的一種補充。

GC-MS有電子轟擊電離(Electron impact，EI)、正化學電離(Chemical ionization，CI)、負化學電離 (Negative chemical ionization，NCI)3種電離方法，其中前兩者較常用。EI具有非選擇性電離的特點，只要樣品氣化都能夠離子化，離子化效率高且碎片較豐富，而豐富的碎片離子能夠提供分子結構的一些重要的官能團信息。CI電離產生的碎片較少，但它能產生準分子離子(Pseudo-molecular ions，M+1)，有利于相對分子質量的測定。NCI主要用于帶電負性基團的化合物如含鹵素的一些化合物［14］。

GC-MS的質量分析器常用的有四級桿質量分析器、離子肼質量分析器、飛行時間質量分析器3種。近年全二維氣相色譜(Comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC)的發(fā)展與應用比傳統(tǒng)一維的氣相色譜更適合分析諸如代謝組學中成分復雜的樣品。GC×GC具有分辨率高、峰容量大、靈敏度高、分析時間短等特點［15］。因此，它與TOF串聯(lián)使用既能精確地分離樣品中的代謝物，又能很好地對代謝物的相對分子質量進行精準測定。Beckstrom等［16］對非靈長類動物圍產期窒息個體的血清樣本(含肝素)進行GC×GC-TOFMS分析，發(fā)現(xiàn)10種顯著性的差異代謝物，其中包括一些已知的生物標記物如乳酸與肌酸酐以及一些特異的差異代謝物如琥珀酸、蘋果酸、花生四烯酸。這3種酸可以作為潛在的生物標記物。Li等［17］分析了Ⅱ型糖尿病患者的血漿樣本，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、2-羥基異丁酸、亞油酸、棕櫚酸和磷酸鹽5種潛在的生物標記物。

3.3 NMR核磁共振產生的光譜通過強磁場和射頻(RF)脈沖作用到原子核形成的。對于原子與任一個奇數(shù)質量數(shù)(如1H、13C等)，磁場的存在將導致原子核具有旋轉能力，也就是核自旋。射頻能量的吸收會使原子核從低能量旋轉狀態(tài)躍升至高能量狀態(tài)，隨后就能檢測到弛豫過程中所發(fā)射的射線。NMR圖譜(特別是化學位移)是根據(jù)電子繞原子核運行所產生的屏蔽效應所做出的。人們通過目標質子與參照物質中相對應的質子之間共振頻率的差異(百萬分之一)來確定1H NMR的化學位移。通常，試驗中人們將四甲基硅烷溶液設置成0 mg/L?；瘜W位移的變化量一般為:1H在0～10 ppm;13C在0～250 ppm［18］。信號強度取決于相同原子核的數(shù)量。

NMR分析樣本時不具有破壞性，且不需要過多的前處理(可直接進樣)，因此可較全面地分析樣本成分，不具有偏向性，但其靈敏度較MS低，難以準確地進行定量分析，故而限制其在代謝組學中的應用。目前，NMR只能對樣品中含量較高的代謝物進行定性分析。近年來，NMR作為代謝組學研究中的重要分析平臺已被廣泛地應用于臨床醫(yī)學診斷中，如腦癌、上皮性卵巢癌、肺癌等癌癥以及阿爾茨海默癥、肌萎縮側索硬化、精神分裂癥等神經(jīng)性疾?。?9］。

目前，代謝組學進行樣本分析時多采用3種平臺同時分析，從而能更加全面地分析樣品的代謝物組成變化，有利于找到更多的潛在生物標記物。

4 數(shù)據(jù)處理分析

代謝組學研究中的數(shù)據(jù)分析包括無監(jiān)督模式識別方法和有監(jiān)督模式識別方法，其中無監(jiān)督模式識別方法主要包括主成分分析(Principal component analysis，PCA)、分層聚類分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)等;有監(jiān)督識別模式方法主要包括偏最小二乘判別分析(Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)、正交信號校正技術偏最小二乘分析(Orthogonal signal correction partial least squares，OPLS)、正交信號校正技術偏最小二乘判別分析(Orthogonal signal correction partial least squares-discriminant analysis，OPLSDA)、隨機森林分析(Random forests，RF)等。其中，PCA、PLS-DA、OPLS-DA使用最廣泛。

PCA數(shù)據(jù)處理后生成的圖有兩種，一種為得分圖，另一種為載荷圖。另外，根據(jù)圖形的維度可分為2D圖和3D圖。得分圖反映各個樣品在空間中的分布情況，可用于觀察樣品的離散情況。樣品點分布越靠近，說明這些樣品的組成接近;樣品點分布越遠，說明樣品間差異越大。PCA中的載荷圖可反映樣品變量分布情況，可利用其識別樣品間潛在的差異化合物。

而PLS-DA與OPLS-DA是在明確樣品分類的情況下，使不同類別樣品盡可能地分開，它們的分類效果要比PCA更好。與PLS-DA相比，OPLS-DA既能更有效地消除數(shù)據(jù)集中的干擾信息對分類判別的影響，又能充分發(fā)揮樣品分類屬性的識別作用，提高分類能力。當獲得分類識別以后，可使用模型變異權重系數(shù)(Variable importance for the projection，VIP)對數(shù)據(jù)進行分析，通過VIP圖來篩選差異化合物(VIP值一般大于1)，然后將這些物質的譜圖與NIST、Metlin、HMDB等數(shù)據(jù)庫進行比對，進而找到潛在的生物標記物。

代謝組學數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的主要目標是簡化數(shù)據(jù)結構，達到判別分類的目的，從而為尋找代謝差異物提供數(shù)據(jù)依據(jù)。另外，也可以通過建立數(shù)據(jù)處理模型，分析代謝差異物的代謝調控關系。代謝組學基本的數(shù)據(jù)處理流程見圖1。

代謝組學研究檢測到的是海量多維的數(shù)據(jù)。分析這些數(shù)據(jù)，需要借助專門的數(shù)理統(tǒng)計和生物信息學軟件，從而快速、高效地呈現(xiàn)可視化的分析結果。目前，代謝組學常用的軟件可大致分為兩類:一類是開放性軟件，包括MATLAB(Matrix laboratory)、SAS(Statistics analysis system)、SIMCA(Soft independent modeling of class analogy)-P、R 軟件、XCMS等;另一類是儀器自帶軟件，包括 MarkerLynx(Waters)、MassHunter(Agilent)、MarkerView(Applied Biosystems/MDS SCIEX)、Bruker Profile Analysis(Bruker)等。

5 闡釋生物學意義

代謝組學的最終目標就是要找到生物體受到某種外界刺激后產生的代謝途徑變化，即通過生物統(tǒng)計的方法分析儀器中的數(shù)據(jù)，盡可能多地找到生物標記物，利用這些標記物描繪出這種代謝途徑的變化。目前，代謝組學主要應用于臨床診斷分析上，通過對一些疾病的生物標記物的檢測，既迅速又準確地診斷疾病［20］。此外，還可以用于對臨床上的差異化治療提供依據(jù)［21］。另外，代謝組學在植物脅迫領域里的應用也有較廣泛的應用前景［5］。

6 結語

盡管代謝組學領域中已有許多成果，但目前還有很多問題亟待解決。首先，3種分析平臺都有分析樣品的局限性，不能較全面地分析樣品內代謝物的組成成分，也就不能更客觀地掌握代謝途徑的變化趨勢，因此，需要突破分析平臺的這種局限性。其次，在數(shù)據(jù)前處理時，在降低背景化學噪聲、變異校準、峰匹配的過程中會出現(xiàn)一些系統(tǒng)性的錯誤，導致產生一些人為添加的數(shù)據(jù)信息。最后，在數(shù)據(jù)分析過程中，分析模型具有不確定性，不能較精準地分析數(shù)據(jù)。這需要我們建立更精確的數(shù)據(jù)分析模型，發(fā)現(xiàn)更多的生物標記物。

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