純種米曲霉AS3.042制曲黃豆醬的后發(fā)酵條件優(yōu)化

康 蕾 劉素純 胡茂豐（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

自然發(fā)酵是自制黃豆醬最常見(jiàn)的發(fā)酵方式，在工廠與實(shí)驗(yàn)室中多采用人工接種不同菌種的方式來(lái)獲得不同口感的產(chǎn)品［1，2］。最常見(jiàn)的制曲菌種為純種米曲霉，其優(yōu)勢(shì)在于蛋白酶活力強(qiáng)［3］。經(jīng)過(guò)制曲階段菌種分解大豆產(chǎn)生蛋白質(zhì)、糖類等有機(jī)物，在加入鹽水的制醬過(guò)程中，這些有機(jī)物會(huì)在酵母菌及乳酸菌等的作用下進(jìn)行分解產(chǎn)生醇、醛、酸、酚、酯類物質(zhì)。其中氨基酸態(tài)氮含量［4］常作為評(píng)判醬品質(zhì)的指標(biāo)。筆者［5］前期曾分別用米曲霉、高大毛霉、根霉、黑曲霉等菌種制曲制醬，發(fā)現(xiàn)米曲霉制曲醬的效果最好，其游離氨基酸含量為174.17mg/g（干基），揮發(fā)性物質(zhì)種類多于其他3種醬，對(duì)香味有貢獻(xiàn)的物質(zhì)含量也最多，在香味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面最理想。吳蘭芳等［6］曾對(duì)曲霉型豆豉制取工藝進(jìn)行優(yōu)化，但目前尚未有關(guān)于用響應(yīng)面法優(yōu)化純種米曲霉AS3.042制曲黃豆醬后發(fā)酵條件的研究。

本研究選取純種米曲霉AS3.042制曲發(fā)酵黃豆醬，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以氨基酸態(tài)氮含量為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化后發(fā)酵溫度、鹽水添加量、鹽水濃度，旨在提高原料轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本，為黃豆的綜合利用和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。研究［5］表明，黃豆醬在后發(fā)酵進(jìn)行40d左右時(shí)氨基酸態(tài)氮含量開(kāi)始趨于穩(wěn)定，因此本研究選取后發(fā)酵40d的醬測(cè)定其氨基酸態(tài)氮含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃豆：市售；

米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院教研室提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子分析天平：BT125D型，廣州深華生物技術(shù)有限公司；

pH計(jì)：PHS－3E型，上海雷磁儀器廠；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP－9052E型，廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃豆醬制作工藝流程

大豆除雜→清洗3遍→浸泡（10h）→瀝干蒸煮→接種制曲→成曲→加鹽水拌勻→入壇發(fā)酵→后期成熟→成品［5］

1.2.2 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定 稱取后發(fā)酵期為40d的黃豆醬5g研磨均勻后，采用甲醛法［7］測(cè)定其氨基酸態(tài)氮含量，每個(gè)樣品做3次平行。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選取氨基酸態(tài)氮作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察后發(fā)酵溫度、添加鹽水濃度、鹽水添加量。121℃蒸煮25min，待大豆冷卻到40℃時(shí)加入純種米曲霉AS3.042，接種量為1%，于一定溫度下培養(yǎng)48h，即得曲坯。

（1）后發(fā)酵溫度對(duì)黃豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響：向曲坯中加入濃度為10%體積為曲坯70%的鹽水，拌勻，放入陶瓷壇子中于30，35，40，45，50℃保溫后發(fā)酵。

（2）鹽水濃度對(duì)黃豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響：向曲坯中加入濃度為6%，8%，10%，12%，14%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）體積為曲坯70%的鹽水，拌勻，放入陶瓷壇子中于40℃保溫后發(fā)酵。

（3）鹽水添加量對(duì)黃豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響：向曲坯中加入濃度為10%體積為曲坯40%，60%，80%，100%，120%（體積百分?jǐn)?shù)）的鹽水，拌勻，放入陶瓷壇子中于40℃保溫后發(fā)酵。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案 取后發(fā)酵期為40d的黃豆醬采用響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，選用Box－Behnken模型對(duì)影響黃豆醬氨基酸態(tài)氮含量的因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)［8］，以氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值進(jìn)行黃豆醬后發(fā)酵條件（溫度、鹽水濃度、鹽水添加量）的優(yōu)化，以得到氨基酸態(tài)氮含量更高的黃豆醬。

2 結(jié)果與分析

2.1 后發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響

圖1 后發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Figure 1 Effect of ferment temperature on the figure of nitrogen amino acid

由圖1可知，后發(fā)酵溫度很大程度上影響了醬品氨基酸態(tài)氮含量，氨基酸態(tài)氮含量隨著溫度的增加先增加后降低，當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降，所以選擇40℃為最適宜后發(fā)酵溫度。高溫可以促進(jìn)蛋白酶作用，縮短蛋白酶水解的時(shí)間，但所得產(chǎn)品的風(fēng)味不濃厚，且色澤偏深；低溫有利于產(chǎn)品風(fēng)味濃厚，但所需時(shí)間較長(zhǎng)［9］。根據(jù)SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件處理可知，溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響顯著（P＜0.05）。

2.2 鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響

由圖2可知，鹽水濃度對(duì)黃豆醬氨基酸態(tài)氮含量的影響較大，氨基酸態(tài)氮含量隨著鹽水濃度增加先增加后降低，當(dāng)濃度超過(guò)10%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）后，氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降，所以選擇10%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）為最適宜添加鹽水濃度。不僅可以抑制酸敗細(xì)菌的生長(zhǎng)還可以保持蛋白酶有較高的活性［10］。根據(jù)SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件處理可知，添加鹽水濃度為10%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）時(shí)對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響顯著（P＜0.05）。

圖2 鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Figure 2 Effect of density of added salty water on the figure of nitrogen amino acid

2.3 鹽水添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響

圖3 鹽水添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Figure 3 Effect of adition of salty water on the figure of nitrogen amino acid

由圖3可知，鹽水添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響較大。黃豆醬中氨基酸態(tài)氮含量隨著鹽水添加量增加先增加后降低，但是當(dāng)添加量超過(guò)80%（體積百分?jǐn)?shù)）后，氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降，所以選擇80%（體積百分?jǐn)?shù)）為最適宜鹽水添加量。水分太少會(huì)抑制酶活性，影響蛋白質(zhì)和淀粉等成分的水解，反之水分太多又會(huì)降低蛋白酶反應(yīng)速率，使得產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量不高，導(dǎo)致風(fēng)味不足［11］。根據(jù)SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件處理可知，鹽水添加量為80%（體積百分?jǐn)?shù)）時(shí)對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響顯著（P＜0.05）。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 綜合單因數(shù)試驗(yàn)結(jié)果，選后發(fā)酵溫度、鹽水濃度、鹽水添加量3個(gè)因素，用Design－Expert 8.0.6軟件按照Box－Behnken原理進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，建立氨基酸態(tài)氮含量對(duì)后發(fā)酵溫度、鹽水濃度、鹽水添加量的二次多項(xiàng)回歸方程見(jiàn)式（1）：

由表3可知，該模型P＜0.000 1，表明二次回歸方程模型極顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.997 3，校正決定系數(shù)＝0.993 8，失擬項(xiàng)P＝0.245 1＞0.05，失擬向不顯著，故對(duì)后發(fā)酵條件的研究可以采用該模型。

表1 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Independent variables their levels used for BBD

各因素對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響均顯著（表3），其中鹽水濃度與鹽水添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響極顯著，表明鹽水濃度與鹽水添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響都很大，交互項(xiàng)AB顯著，即后發(fā)酵溫度與鹽水濃度存在交互作用，表明后發(fā)酵溫度與鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。＊＊＊表示差異極顯著（P＜0.001）；＊＊表示差異高度顯著（P＜0.01）；＊表示差異顯著（P＜0.05）；R2＝0.997 3；＝0.993 8。

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box－Behnken experimental design and results

表3 回歸模型分析Table 3 Analysis of regression model

表3 回歸模型分析Table 3 Analysis of regression model

方差來(lái)源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 0.075 9 8.322×10－3 284.18 ＜0.000 1＊＊＊A 3.125×10－4 1 3.125×10－4 10.67 0.013 7 ＊B 6.050×10－3 1 6.050×10－3 206.59 ＜0.000 1 ＊＊＊C 3.612×10－3 1 3.612×10－3 123.35 ＜0.000 1 ＊＊＊AB 2.250×10－4 1 2.250×10－4 7.68 0.027 6 ＊AC 1.000×10－4 1 1.000×10－4 3.41 0.107 1 BC 2.500×10－5 1 2.500×10－5 0.85 0.386 3 A2 0.028 1 0.028 943.30 ＜0.000 1 ＊＊B2 0.012 1 0.012 411.52 ＜0.000 1 ＊＊C2 0.018 1 0.018 626.28 ＜0.000 1 ＊＊?dú)埐?2.050×10－3 7 2.929×10 －5失擬向 1.250×10－4 3 4.167×10－5 2.08 0.245 1 不顯著純誤差 8.000×10－3 4 2.000×10－5總和0.075 16

2.4.3 因素間交互作用分析 由圖4可知，當(dāng)鹽水添加量固定在80%（體積百分?jǐn)?shù)）時(shí)，研究后發(fā)酵溫度與鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的交互影響，氨基酸態(tài)氮含量隨著后發(fā)酵溫度與鹽水濃度的增加而提高，在40℃左右，8%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）時(shí)含量最高，后發(fā)酵溫度與鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響顯著，兩者對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的提高起到了一定的作用。由圖5可知，當(dāng)鹽水添加量為80%（體積百分?jǐn)?shù)），后發(fā)酵溫度與鹽水濃度的交互作用不顯著，在所選范圍內(nèi)無(wú)極值；由圖6可知，當(dāng)溫度固定在40℃時(shí)，鹽水濃度與添加量的交互作用不顯著，在所選范圍內(nèi)無(wú)極值。

圖4 后發(fā)酵溫度與鹽水添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的響應(yīng)面分析Figure 4 The Response surface of effects of temperature and adition of salty water on the figure of nitrogen amino acid

圖5 后發(fā)酵溫度與鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的響應(yīng)面分析Figure 5 Response surface plots of effects of temperature and density of added salty water on the figure of nitrogen amino acid

圖6 鹽水濃度與鹽水添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的響應(yīng)面分析Figure 6 The Response surface of effects of density of added salty water and adition of salty water on the figure of nitrogen amino acid

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化模型診斷 實(shí)際值與回歸估計(jì)值的差稱為殘差，通過(guò)殘差信息，可分析數(shù)據(jù)的可靠性、周期性或其它干擾。殘差分析原理是在模型無(wú)法完全解釋變異的基礎(chǔ)上借助圖形分析工具進(jìn)行分析的，通常用于診斷響應(yīng)面優(yōu)化模型的好壞［12］。檢驗(yàn)誤差方差齊性在模型診斷中具有重要意義。如果預(yù)測(cè)值內(nèi)部t化殘差呈隨機(jī)散點(diǎn)分布，則殘差方差齊性是合符要求的［13］。此外，殘差正態(tài)分布也是檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)確性的重要工具，如殘差呈正態(tài)概率分布，則殘差擬合曲線呈線性態(tài)勢(shì)（圖7）［14］。由圖8可知，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值擬合度較高，試驗(yàn)誤差較小。模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值若擬合良好，則數(shù)據(jù)散點(diǎn)分布且沿模型診斷線呈近似直線分布。微擾曲線（perturbation plot）可在響應(yīng)優(yōu)化曲面特定區(qū)域比較各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響，如曲線陡直，表明響應(yīng)值對(duì)因素敏感，如曲線平緩，則表明響應(yīng)值對(duì)因素變化不敏感。由圖9可知，因素B（鹽水添加量）對(duì)響應(yīng)值最敏感，因素C（鹽水濃度）對(duì)響應(yīng)值較為敏感，而A（后發(fā)酵溫度）對(duì)響應(yīng)值變化不敏感。因此，因素B為最重要因素，其影響為正影響［15］。

圖8 模型預(yù)測(cè)值VS實(shí)測(cè)值Figure 8 Predicted vs.Actual

圖9微擾曲線Figure 9 Perturbation plot

2.4.5 優(yōu)化后發(fā)酵工藝參數(shù)的驗(yàn)證 采用Design Expert軟件，分析得到的最佳工藝條件為：后發(fā)酵溫度40.28℃、鹽水添加量74.7%（體積百分?jǐn)?shù)）、鹽水濃度9.66%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)），產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量為0.841g/kg。采用黃豆醬后發(fā)酵條件為溫度40.3℃、鹽水添加量74.7%（體積百分?jǐn)?shù)）、鹽水濃度為9.7%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)），進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，黃豆醬的氨基酸態(tài)氮含量平均值為0.837 6g/kg，與理論值很接近。說(shuō)明該工藝參數(shù)是可行的。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化黃豆醬后發(fā)酵條件，通過(guò)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行分析，確定黃豆醬后發(fā)酵條件為溫度40.3℃、鹽水添加量74.7%（體積百分?jǐn)?shù)）、鹽水濃度為9.7%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)），該條件下氨基酸態(tài)氮含量為0.837 6g/kg。本研究采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化后發(fā)酵條件，提高了原料轉(zhuǎn)化率，降低了生產(chǎn)成本，對(duì)發(fā)酵豆類調(diào)味品的綜合利用和開(kāi)發(fā)具有較大參考價(jià)值。

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