HIF-1α和 MMP9促進(jìn)浸潤性乳腺癌中血管生成

王丹娜 朱 博 武世伍 承澤農(nóng)雷 洋

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠 233000）

HIF-1α和 MMP9促進(jìn)浸潤性乳腺癌中血管生成

王丹娜 朱 博 武世伍 承澤農(nóng)*雷 洋

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠 233000）

目的 探討浸潤性乳腺癌（infiltrating breast carcinoma，IBC）組織中HIF-1α和MMP9的表達(dá)情況與血管生成的關(guān)系及其臨床病理意義。方法 采用免疫組織化學(xué) ElivisionTMplus法檢測 115例 IBC組織和 20例乳腺纖維腺瘤中 HIF-1α和MMP9的表達(dá)情況以及微血管密度（microvessel density，MVD）。結(jié)果 在IBC組織和乳腺纖維腺瘤中HIF-1α和MMP9的陽性表達(dá)率分別為60.9%、62.6%和10%、10%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HIF-1α和 MMP9蛋白的表達(dá)水平與腫瘤組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、臨床分期及Her-2表達(dá)均有關(guān)；MVD計(jì)數(shù)與腫瘤患者是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及 Her-2表達(dá)均相關(guān)；且 HIF-1α、MMP9蛋白的表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)相互之間均呈正相關(guān)性。結(jié)論 HIF-1α和 MMP9的過表達(dá)促進(jìn)了IBC的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，MVD計(jì)數(shù)升高進(jìn)一步促進(jìn)IBC的轉(zhuǎn)移過程；聯(lián)合檢測HIF-1α、MMP9和 MVD對 IBC患者的進(jìn)展及預(yù)后判斷有重要意義。

乳腺腫瘤；HIF-1α；MMP9；微血管密度；預(yù)后

乳腺癌在所有惡性腫瘤中排第二位，是女性最常見的惡性腫瘤，每年因其死亡的人數(shù)在女性腫瘤占第一位［1］。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其導(dǎo)致患者死亡的主要原因。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)缺氧時(shí)，廣泛表達(dá)于人體多種組織，在腫瘤組織中也普遍表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)缺氧環(huán)境時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄基因，其表達(dá)增高參與了腫瘤的侵襲、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及血管生成等多種生物學(xué)行為［2］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組金屬離子依賴的蛋白酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白，其活性程度與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。MMP9是MMPs家族中的一員，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分而備受關(guān)注。近年來的研究表明［3-4］，由缺氧介導(dǎo)的HIF-1α和 MMPs表達(dá)增加可能與腫瘤的血管生成具有一定的關(guān)系。目前最常用的反映血管生成的指標(biāo)——微血管密度（microvessel density，MVD），與腫瘤的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MVD通常通過 CD34陽性表達(dá)的小管腔來計(jì)數(shù)。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測115例乳腺浸潤性癌（infiltrating breast carcinoma，IBC）患者中 HIF-1α、MMP9和 CD34蛋白的表達(dá)，分析 HIF-1α和MMP9蛋白表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)之間的關(guān)系，并探討它們與IBC浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

材料和方法

1.一般資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2007年1月至12月存檔石蠟包埋 IBC組織標(biāo)本115例（術(shù)前未行放、化療）和纖維腺瘤組織標(biāo)本20例。所有病例均經(jīng)本院病理診斷為IBC，均有完整的臨床和病理資料。臨床資料包括年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床病理分期（見表 1）。其中臨床病理分期是根據(jù) UICC和 AJCC最新分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。20例乳腺纖維腺瘤組織標(biāo)本設(shè)為對照組，中位年齡50.6歲。

2.試劑

鼠抗人 HIF-1α單 克 隆 抗 體（產(chǎn)品 編 號：SC53546）購自美國 Santa Cruz公司；鼠抗人 MMP9單克隆抗體（克隆號：15W2）購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；鼠抗人 CD34單克隆抗體 （克隆號QBEnd／10）、Elivision試劑盒以及 DAB顯示試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法

所有標(biāo)本均經(jīng) 10%中性甲醛溶液固定，組織以石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片、烤干，接著于二甲苯溶液及不同的濃度梯度乙醇溶液中脫蠟至水洗，采用免疫組織化學(xué) ElivisionTMplus法，所有試劑均按試劑盒說明步驟進(jìn)行。利用已知陽性片作對照，以 PBS液代替一抗作為空白對照。

4.結(jié)果判定

HIF-1α、MMP9均以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；ER、PR均以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性；Her-2以細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和范圍來綜合計(jì)分，染色強(qiáng)度分為：無色，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分；范圍分為：陽性細(xì)胞為＜10%，1分；11%～50%，2分；51% ～75%，3分；＞75%，4分。具體計(jì)分方法見相關(guān)文獻(xiàn)［5］，若積分≥3分為陽性，＜3分為陰性。CD34以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，MVD通過CD34陽性表達(dá)的小管腔來計(jì)數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)中倍視野中的小管腔數(shù)，計(jì)數(shù)方法見參考文獻(xiàn)［6］。免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位病理醫(yī)師通過獨(dú)立雙盲法判定。

5.統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在IBC組織中，HIF-1α、MMP9蛋白的表達(dá)以及MVD計(jì)數(shù)與纖維腺瘤組織、各臨床及病理因素的相關(guān)性采用X2、spearman等級相關(guān)以及t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HIF-1α在 IBC的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系

在對照組中，HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率為10%（2／20），在 IBC組織中，HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率為60.9%（70／115）（圖1A、圖1B），兩組之間差異有顯著性（P＜0.01）；HIF-1α蛋白的表達(dá)與IBC組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及 Her-2的表達(dá)均相關(guān)（表1）。

2.MMP9在 IBC中的的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

MMP9蛋白在對照中的陽性表達(dá)率為10%（2／20），在IBC組中的陽性表達(dá)率為 62.6%（72／115）（圖1C、圖1D），兩組之間差異有顯著性（P＜0.01）；MMP9蛋白的表達(dá)率與 IBC組織的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均有關(guān)（全部 P＜0.05）（表 1），且MMP9的表達(dá)與 Her-2的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

3.MVD與臨床病理因素的關(guān)系

MVD計(jì)數(shù)與患者的腫瘤大小、分化程度及 PR的表達(dá)等均無關(guān)（P＞0.05，表 1）；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，MVD的計(jì)數(shù)顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組（圖1E、圖1F），且 MVD計(jì)數(shù)高低與臨床分期及 ER的表達(dá)有關(guān)，差異均有顯著性（P＜0.05）。

4.IBC組織中 HIF-1α、MMP9蛋白的表達(dá)與 MVD計(jì)數(shù)之間的關(guān)系

MVD計(jì)數(shù)與HIF-1α蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.522，P＜0.001）；MVD計(jì)數(shù)與MMP9蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.492，P＜0.001）（表2）。

圖1 HIF-1α、MMP9和MVD在對照組和IBC組中的表達(dá)和計(jì)數(shù)情況。A：在對照組中HIF-1α的陰性表達(dá)（Elivision100×）；B：在低分化IBC組織中 HIF-1α的陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞漿和膜（Elivision100×）；C：對照組中 MMP9的陰性表達(dá)（Elivision100×）；D：在低分化IBC組織中 MMP9的陽性表達(dá)，主要定位于胞漿和膜（Elivision400×）；E：在低分化IBC中的低MVD計(jì)數(shù)（Elivision100×）；F：在低分化IBC中的高 MVD計(jì)數(shù)（Elivision100×）Fig.1 Expression of HIF-1αand MMP9 and the score of MVD in TBC and CON.A：negative staining of HIF-1αin CON（Elivision100×）；B：positive staining of HIF-1αin cytoplasm and membrane of poorly grade IBC（Elivision100×）；C：negative staining of MMP9 in CON（Elivision100×）；D：positive staining of MMP9 in cytoplasm and membrane of poorly grade IBC（Elivision400×）；E：the low score of MVD in poorly grade IBC（Elivision100×）；F：the high score of MVD in poorly grade IBC（Elivision100×）

表1 IBC組織中 HIF-1α、MMP9表達(dá)和 MVD計(jì)數(shù)與臨床病理因素的關(guān)系Table 1 correlation of HIF-1αand MMP9 expression and the score of MVD with clinicopathollgic characteristics in IBC

續(xù)表

表2 IBC組織中HIF-1α、MMP9、MVD、ER、PR和Her-2各因素之間的相互關(guān)系Table 2 the expression of HIF-1αand MMP9 and ER and PR and cerbB-2 and the score of MVD and their relationship in IBC

討 論

缺氧和缺血是實(shí)體腫瘤的一個(gè)基本特征，缺氧不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，同時(shí)也是腫瘤對治療產(chǎn)生耐受性的原因之一［7］。HIF-1是由 α亞基和 β亞基構(gòu)成的異源二聚體，而 HIF-1α對缺氧反應(yīng)極其敏感，是氧反應(yīng)亞基，只與 O2代謝有關(guān)。該基因位于人 14號染色體，并編碼 826個(gè)氨基酸。當(dāng)細(xì)胞缺氧時(shí)，HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增高，通過誘導(dǎo)多種基因表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧的微環(huán)境；或可以通過促進(jìn)新生血管形成及調(diào)控多種靶基因表達(dá)以逃避相對缺氧的微環(huán)境，從而促進(jìn)了腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測115例浸潤性乳腺癌（infiltrating breast cancer，IBC）組織和20例乳腺纖維腺瘤組織中 HIF-1α蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) IBC組織中 HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯高于乳腺纖維腺瘤組織，差異有顯著性；并且腫瘤的分化越差，其陽性表達(dá)率也越高，差異有顯著性；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組；臨床分期越高，HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率越高，提示 HIF-1α蛋白表達(dá)增高與IBC的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與其他學(xué)者的研 究 結(jié) 果 一 致［5，9］。

生理狀態(tài)下，MMP9可以降解任何細(xì)胞外基質(zhì)，參與胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷修復(fù)等功能；異常時(shí)，MMP9通過破壞局部組織的細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜屏障，促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP9蛋白陽性表達(dá)率高的腫瘤具有分化差、易淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床 分期高 等特點(diǎn)，與以往 的研究結(jié) 果 一致［9-10］。眾所周知，當(dāng)腫瘤組織生長到 1mm3時(shí)，就會(huì)通過誘導(dǎo)原有的內(nèi)皮細(xì)胞通過芽生或通過誘導(dǎo)內(nèi)皮前體細(xì)胞分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞后再形成新的血管，以緩解自身的缺血缺氧。微血管密度（microvessel density，MVD）是反映血管活性中最常用的一種指標(biāo)，本研究采用 CD34抗體來標(biāo)記微血管密度，發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IBC患者中，其 MVD的計(jì)數(shù)明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。MVD的計(jì)數(shù)與患者的年齡、腫瘤大小等無關(guān)。

Spearman相關(guān)分析顯示，IBC組織中微血管的形成與HIF-1α及 MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系；HIF-1α蛋白的表達(dá)與 MMP9蛋白的表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系。且MVD、HIF-1α及MMP9的表達(dá)都與 Her-2的表達(dá)呈正相關(guān)性。由此我們可以推測，隨著腫瘤的快速生長及發(fā)展，腫瘤組織缺血缺氧越來越明顯，而缺血缺氧的刺激可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α的活化，通過上調(diào)腫瘤組織的MMP9的表達(dá)，破壞和重建細(xì)胞外基質(zhì)，并促進(jìn)血管的形成，以上步驟最終導(dǎo)致腫瘤組織易于侵襲及轉(zhuǎn)移，使得患者的生存期更短，預(yù)后更差。此外有研究表明［11］，Her-2的過表達(dá)可以激活 PI3K／Akt信號通路，從而增強(qiáng) HIF-1α的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞更加耐受缺血缺氧。

綜上所述，HIF-1α基因高表達(dá)是 IBC細(xì)胞耐受缺血、缺氧的分子基礎(chǔ)，而MMP9的表達(dá)異常增高可能是促進(jìn) IBC血管生成，從而進(jìn)一步發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件。因此，聯(lián)合檢測 HIF-1α、MMP9和MVD計(jì)數(shù)情況對于評估 IBC患者的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有一定的預(yù)測價(jià)值。

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HIF-1α and MMP9 promote angiogenesis in infiltrating breast carcinoma

Wang Danna，Zhu Bo，Wu Shiwu，Cheng Zenong*，Lei yang
（Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College；Department of Pathology，Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China）

Objective To investigate the expression levels of HIF-1α and MMP and microvessel density（MVD）in infiltrating breast carcinoma（IBC）and evaluate their clinicopathological significance.Methods MVD scores marked by CD34 and the expression of HIF-1α and MMP9 were examined by immunohistochemistry in 115 specimens of IBC tissues and 20 specimens of breast fibroadenoma tissues.Results The positive rates of HIF-1α and MMP9 in IBC and breast fibroadenoma were 60.9%，62.6%and 10%，10%，respectively.The expression of HIF-1α and MMP9 was significantly related to grades of tumor，lymph node metastasis，pTNM stages，and Her-2 expression.The score of MVD was significantly related to lymph node metastasis，pTNM stages，and Her-2 expression.There was a positive relationship between HIF-1α and MMP9 expression and MVD score.Conclusion The overexpression of HIF-1α and MMP9 may promote IBC progression，invasion and metastasis，and the high score of MVD may further promote IBC metastasis.The combined detection of HIF-1α，MMP9，and MVD might be a useful approach in predicting the progression and prognosis of IBC.

Breast neoplasms；HIF-1α；MMP9；Microvessel density；Prognosis

R732.9

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.006

2015-03-15

2015-09-11

王丹娜，女（1988年），漢族，助理實(shí)驗(yàn)師

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：961219269＠qq.com