CD151通過 ERK促進體外血管生成

沈小清 楊秀婷 左后娟 劉正湘 費宇杰 劉曌宇

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院：1心血管內(nèi)科；2消化內(nèi)科，武漢 430030）

論 著

CD151通過 ERK促進體外血管生成

沈小清 楊秀婷 左后娟 劉正湘 費宇杰 劉曌宇*

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院：1心血管內(nèi)科；2消化內(nèi)科，武漢 430030）

目的 探討 p38MAPK信號通路及ERK信號通路激活在 CD151促進體外基質膠（matrigel）上類微血管結構形成的機制。方法 包裝 CD151、antiCD151和 GFP的重組腺相關病毒并轉染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）。將轉染后的細胞種植在 Matrigel上，觀察其管型結構的形成。Western Blot法檢測CD151、ERK、p38MAPK蛋白的表達；給予 ERK抑制劑、p38 MAPK抑制劑，分別觀察其對 CD151促進管型結構形成的影響。結果 CD151高表達組較對照組及 GFP組顯著促進 HUVECs matrigel上管型結構形成。高表達的CD151能夠促進p-ERK的表達，但是對 p-p38MAPK的蛋白表達影響不明顯。ERK抑制劑能顯著減弱 CD151對管型結構形成的促進作用，但 p38 MAPK抑制劑則對CD151促進管型結構的形成無顯著影響。結論 高表達的 CD151通過激活 ERK信號通路促進HUVECs在 matrigel上管型結構形成，其作用與p38 MAPK信號通路的激活無明顯關系。

CD151；血管生成；胞外信號調節(jié)激酶；絲裂原活化蛋白激酶

血管生成（angiogenesis）在諸多疾病尤其是心血管疾病的病理生理過程中起著舉足輕重的作用。隨著冠脈血管病變的嚴重性和復雜性，傳統(tǒng)治療方法難以奏效，故“治療性血管生成”為當前缺血性心血管疾病研究熱點之一，多種促血管生成的因子也相繼被發(fā)現(xiàn)并報道。

CD151是 TM4SF家族最重要的成員之一［1-3］，它在內(nèi)皮細胞呈高表達，與多種整合素（α6β1、α3β1等）特異性結合形成 CD151-整合素復合體，參與調節(jié)細胞多種功能，包括調節(jié)細胞形態(tài)、增殖、粘附、遷移、腫瘤細胞的侵襲及轉移等過程［4-7］。近年來，國外研究發(fā)現(xiàn)CD151在維持細胞形態(tài)和血管穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，CD151敲除則導致病理性的血管生成顯著被破壞。故 CD151在血管生成中的作用越來越值得研究和重視。我們課題組前期有多項研究證實CD151高表達可促進小型豬缺血心肌組織的微血管和小動脈的生成，促進側枝循環(huán)的建立，顯著改善缺血心肌組織的血流灌注［8］；CD151高表達可促進大鼠缺血后肢的微血管形成和功能恢復［9，10］。但是，CD151促血管生成的機制尚不清楚。

既往發(fā)現(xiàn)CD151高表達可促進細胞遷移并促進體外管型結構形成，且可促進 ERK信號通路的激活［11］，但是，CD151的促體外管型結構形成是否由ERK介導并不清楚；而其他信號通路如p38MAPK信號通路是否也參與 CD151促管型結構形成的作用尚未見報道。本研究主要探討ERK信號通路和p38MAPK信號通路在 CD151促體外血管生成中的作用。

材料和方法

1.材料

1.1 細菌與質粒

pZeoSV-CD151由美國 Tennessee大學惠贈。HUVEC細胞購自武漢大學物種保存中心。pAAVCD151-HA重組質粒由本課題組前期構建［10］，rAAV包裝質粒 pXX2、腺病毒輔助質粒 phelper、真核表達載體pXXUF1含綠色熒光蛋白序列（Green fluorescentprotein，GFP）由美國Pittsburgh大學分子遺傳及生物 化 學系 Xiao Xiao博士 惠 贈。工 程 菌 株E.ColiDH5a由同濟醫(yī)院心血管研究室保存。293細胞購自ATCC（美國）。

1.2 主要試劑

所有細胞培養(yǎng)的標準試劑，胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶等均購自 GIBCO公司。蛋白質提取試劑Trizol購自美國Life technologies公司。羊抗兔CD151、鼠抗β-actin、兔抗p38MAPK、兔抗phospho-p38MAPK、兔 抗 ERK1／2、兔 抗 phospho-ERK1／2購自美國 Santa Cruz Biotechnology公司。Western雜交顯影用增強的化學發(fā)光試劑（SuperSignal Substrate，ECL）購自美國 Pierce公司。辣根過氧化酶標記兔抗羊 IgG、兔抗鼠IgG和羊抗兔 IgG購自美國Pierce公司。p38 MAPK抑制劑（SB203580）購自Calbiochem公司，ERK抑制劑（PD098059）購自Gibco公司。Matrigel購自德國 R＆D Biosciences公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

2.方法

2.1 質粒構建及酶切鑒定

pAAV-CD151、pAAV-antiCD151和 pAAV-GFP質粒的由本課題組前期構建［10］。將構建的 CD151和antiCD151分別轉化大腸桿菌DH 5α，挑選陽性單克隆，進行酶切鑒定。

2.2 重組腺相關病毒的包裝及滴度測定

堿裂解法分別大量提取 pAAV-GFP、pXX2、phelper和pAAV-CD151、pAAV-antiCD151質粒，并用聚乙二醇超速離心純化。用磷酸鈣三質粒共轉染法轉染293細胞包裝rAAV-CDl51、rAAV-antiCD151和rAAV-GFP病毒［10］，收獲病毒原液，純化后備用。斑點雜交法測定病毒滴度［10］。

2.3 HUVEC培養(yǎng)

HUVEC用含胎牛血清、肝素鈉的DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰酶消化后傳代，制成細胞懸液，細胞計數(shù)后傳至六孔板。隨機分為四組：空白對照組、GFP組、CD151組、antiCD151組，根據(jù)病毒滴度于上述四組中按 500pfu／個細胞分別加入等體積 PBS、rAAV-GFP、rAAV-CD151和 rAAV-antiCD151轉染。在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)箱中過夜，次日各孔分別加入1 ml DMEM新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 體外 Matrigel管型結構形成實驗

轉染 rAAV-CD151、rAAV-antiCD151和 rAAVGFP的細胞 5天后，更換成無血清的 DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。將 Matrigel置于冰浴中6 h溶解；以預冷的滅菌槍取250（l鋪于24孔板底部，置冰浴，消除氣泡；置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱30 min使膠凝固；用0.05%的胰酶（含0.02%的EDTA）消化各組細胞，含0.5%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基調整細胞為1×105／mL，每孔加入100 μl細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，并在顯微鏡下照相，選取 5個視野，使用 Scion Image軟件計算類微血管結構的區(qū)域面積。

2.5 CD151、ERK、p38MAPK免疫印跡檢測

收集各組按上述方法進行轉染的細胞并提取總蛋白。配制SDS-PAGE凝膠，取含等量蛋白的裂解液，常規(guī)電泳，轉膜，封閉；加入鼠抗人 CD151（或ERK、p38MAPK抗體）（1：1000），4℃過夜。加入相應的二抗（1：5000），37℃孵育2 h；ECL顯色；GENE SNAP TOOL軟件分析目的條帶相對吸光度值，各組數(shù)據(jù)均用相應的 β-actin進行標準化處理。

2.6 CD151促血管生成的信號轉導機制檢測

在上述 matrigel的實驗中，分別給予rAAVCD151轉染＋ERK抑制劑（PD98059，20 μmol／L），或＋p38 MAPK抑制劑（SB203580，20 μmol／L）。轉染后，再按上述方法檢測細胞體外管型結構的形成。

2.8 統(tǒng)計學方法

結 果

1.病毒轉染效率檢測

本實驗中采用三質粒共轉染法進行病毒的包裝。攜帶報告基因 GFP三質粒共轉染法包裝病毒，轉染 24～48 h后，檢測病毒包裝的轉染效率可達90%以上（圖1）。其后，病毒轉染細胞時，再進行病毒轉染的轉染率檢測，轉染率可達70%。

圖1 三質粒共轉染48 h后觀察GFP表達，大多數(shù)細胞內(nèi)均有GFP表達（400×）Fig.1 The GFP expression observed with inverted fluorescence microscope at 48h after triple-plasmid cotransfection

2.轉染細胞后 CD151蛋白的表達

分別用rAAV-CD151、rAAV-antiCD151轉染HUVECs細胞，結果發(fā)現(xiàn) rAAV-CD151組 CD151蛋白表達明顯較對照組和 rAAV-GFP組增加，差異有顯著意義（P＜0.05），而rAAV-antiCD151組CD151的蛋白表達則明顯低于 rAAV-CD151組（P＜0.05）（圖2）。結果說明 rAAV-CD151促進了CD151蛋白的表達，而 rAAV-antiCD151則抑制蛋白的表達。

3.CD151促進體外管型結構的形成

與對照組和rAAV-GFP組相比，rAAV-CD151組體外管型結構形成明顯增多（P＜0.05）；rAAV-antiCD151組與rAAV-CD151組比較，管型結構形成能力明顯減弱，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3，4）。結果說明CD151基因轉染能促進體外管型結構的形成，而 antiCD151則抑制體外管型結構的形成。

圖2 Western blot法檢測病毒轉染后細胞 CD151蛋白表達（n＝3）。CD151蛋白表達的相對吸光度值，均以均數(shù) ±標準差表示。＃，和對照組、rAAV-GFP組比較P＜0.05；*，和rAAV-CD151組比較P＜0.05Fig.2 Western blot analysis for the CD151 protein expression after rAAVs transfection.The relative density of CD151 protein expression.Data are mean±SEM.＃，P＜0.05 vs the control group and rAAV-GFP group；*，P＜0.05 vs the rAAV-CD151 group

圖3 在 Matrigel上類管型結構形成（n＝3）。相差顯微鏡結果Fig.3 The capillary-like tube formation on Matrigel（n＝3）.The results was shown by inverted phase contrast microscope

圖4 Matrigel上管型結構形成（n＝3）。使用Scion Image軟件分析后的統(tǒng)計結果。＃，和對照組、rAAV-GFP組比較P＜0.05。*，和rAAV-CD151組比較P＜0.05Fig.4 The area of the capillary-like tube formation on Matrigel（n＝3）.Quantitative analysis of the effect of CD151 on tube formation by Scion Image.＃，P＜0.05 vs the control group and rAAV-GFP group；*，P＜0.05 vs the rAAV-CD151 group

4.ERK及 p38MAPK信號通路的激活

各組p-ERK、p-p38MAPK分別用ERK、p38MAPK進行標準化處理。結果顯示rAAV-CD151組 p-ERK／ERK表達明顯高于對照組和rAAV-GFP組，rAAV-antiCD151組 p-ERK／ERK表達明顯低于rAAV-CD151組（P＜0.05）；而p-p38MAPK／p38MAPK表達在各組之間的差異不明顯（P＞0.05）（圖5）。結果說明CD151可顯著促進 ERK的磷酸化激活，而對p38 MAPK的磷酸化激活無顯著作用。

圖5 Western blot法檢測ERK、MAPKs蛋白表達。＃，P＜0.05與對照組、rAAV-GFP組比較 P＜0.05；與rAAV-CD151組比較P＜0.05Fig.5 Western blot analysis for the ERK and MAPKs proteins expression.＃，P＜0.05 vs the control group and rAAV-GFP group；*，P＜0.05 vs the rAAV-CD151 group

5.ERK及 p38MAPK信號通路的激活在 CD151促進體外管型結構形成中的作用

重組腺相關病毒介導 CD151轉染HUVECS細胞的同時，分別給予 ERK抑制劑或 p38 MAPK抑制劑，觀察體外血管管型結構的形成。結果顯示，ERK抑制劑顯著抑制 CD151轉染后促進的管型結構的形成（P＜0.05），提示ERK介導了 CD151促進的管型結構形成的作用（圖6）。而 p38MAPK則在 CD151促進管型結構形成中的作用不明顯。

圖6 CD151促類微血管結構形成的信號轉導機制（n＝3）。使用Scion Image軟件分析后的統(tǒng)計結果。＃，與對照組、rAAVGFP組比較P＜0.05；*，與信號轉導抑制劑外其它組比較P＜0.05Fig.6 Signal transduction mechanism of CD151 promoting the capillary-like tube formation.Quantitative analysis of the effect of CD151 on tube formation by Scion Image.＃，P＜0.05 vs the control group and rAAV-GFP group；*，P＜0.05 vs the groups without inhibitors

討 論

TM4SF是整合素（integrin）重要的關聯(lián)蛋白，是近年來被高度關注的一個基因家族，其中，CD151是TM4SF最重要的成員之一。CD151與多種整合素（α6β1、α3β1等）特異性結合形成 CD151-整合素復合體，作為眾多信號轉導分子的 “跨膜連接器”［12，13］。其中，CD151在血管生成的作用尤為引起研究的關注。

CD151在內(nèi)皮細胞表達較高，而高表達CD151蛋白則可促進內(nèi)皮細胞的遷移和遷移［14，15］。而CD151基因敲除小鼠的病理性血管生成顯著被破壞，血管生成中的眾多步驟如：遷移、伸展、浸潤、基質膠接觸、條索生成及出芽均受到影響［16］；此外，CD151尤其影響生成血管的穩(wěn)定性，CD151敲除則導致已生成血管的滲透性顯著增加，生成的血管被破壞而不能維持［17］。我們課題組前期進行了有關 CD151與血管生成的體內(nèi)研究，研究結果證實 CD151可促進缺血心肌組織的微血管形成，改善心梗后的心功能［8］。這些研究表明CD151具有促進體內(nèi)外血管生成的作用，但是，其促血管生成的機制尚不清楚。

既往對CD151的機制研究發(fā)現(xiàn)，CD151能抑制RAS途徑，Sawada等在鼠成纖維細胞中轉染CD151質粒，他們發(fā)現(xiàn) CD151下調PKB／c-Akt和 ERK1／2的表達，即 CD151在成纖維細胞中對ERK有抑制作用［18］。Takeda等進行 CD151基因敲除小鼠的研究，他們發(fā)現(xiàn) CD151基因敲除的肺內(nèi)皮細胞中導致 PKB／c-Akt、e-NOS、Rac及 Cdc42活性減弱，但是，Raf、ERK、p38MAPK、FAK和 Src的活性未發(fā)生變化［16］，即CD151對ERK、p38MAPK信號通路的激活無顯著作用。那么，在血管生成的過程中，ERK、p38MAPK信號通路的激活是否參與 CD151的促血管生成作用呢？我們研究發(fā)現(xiàn)CD151高表達可促進 ERK信號通路激活，但是，對 p38MAPK信號通路的激活無顯著作用。但是，CD151可促進ERK信號激活，ERK信號通路是否介導 CD151促管型結構形成作用呢？

進一步的研究中，我們在 CD151轉染細胞的同時分別加用了ERK抑制劑（PD98059）及 p38 MAPK抑制劑（SB203580）。我們的研究結果顯示ERK抑制劑能部分逆轉 CD151促 matrigel上管型結構形成作用，即ERK信號通路部分介導 CD151在 matrigel上促管型結構形成的作用。而 p38 MAPK抑制劑對此無顯著作用。

本研究結果揭示了ERK信號通路和p38 MAPK信號通路在CD151促體外血管生成中的作用，這些結果說明 CD151可通過激活 ERK信號通路促進體外 matrigel上的管型結構生成，而 p38 MAPK信號通路不參與 CD151的促管型結構生成的作用。然而，血管生成是個極其復雜的過程，管型結構的形成只是其中某一個步驟。下一步的研究中，我們將探討CD151在粘附、遷移、維持血管穩(wěn)定性方面的機制。

［1］Hemler ME.Tetraspanin functions and associated microdomains.Nat Rev Mol Cell Biol.2005；6（10）：801-811

［2］Fu H，Tan J，Yin Q.Effects of recombinant adeno-associated virus-mediated CD151 gene transfer on the expression of rat vascular endothelial growth factor in ischemic myocardium.Exp Ther Med.2015；9（1）：187-190

［3］Baldwin G，Novitskaya V，Sadej R，Pochec E，Litynska A，Hartmann C，Williams J，Ashman L，Eble JA，Berditchevski F.Tetraspanin CD151 regulates glycosylation of（alpha）3（beta）1 integrin.JBiolChem.2008；283（51）：35445-35454

［4］Lammerding J，Kazarov AR，Huang H，et al.Tetraspanin CD151 regulates alpha6beta1 integrin adhesion strengthening.Proc Natl Acas Sci USA.2003；100：7616-7621

［5］Sincock PM，F(xiàn)itter S，Parton RG，et al.PETA-3／CD151，a member of the transmembrane 4 superfamily，is localised to the plasma membrane and endocytic system of endothelial cells，associates with multiple integrins and modulates cell function.J Cell Sci.1999；112：833-844

［6］Palmer TD，Martínez CH，Vasquez C，et al.Integrin-free tetraspanin CD151 can inhibit tumor cell motility upon clustering and is a clinical indicator of prostate cancer progression.Cancer Res.2014；74（1）：173-187

［7］Li P，Zeng H，Qin J，et al.Effects of tetraspanin CD151 inhibition on A549 human lung adenocarcinoma cells.Mol Med Rep.2015；11（2）：1258-1265

［8］Zuo H，Liu Z，Liu X，et al.CD151 gene delivery after myocardial infarction promotes functional neovascularization and activates FAK signaling.Mol Med.2009；15（9-10）：307-315

［9］Liu WF，Zuo HJ，Chai BL，et al.Role of tetraspanin CD151-α3／α6 integrin complex：Implication in angiogenesis CD151-integrin complex in angiogenesis.Int J Biochem Cell Biol.2011.43（4）：642-650

［10］Lan RF，Liu ZX，Liu XC，et al.CD151 promotes neovascularization and improves blood perfusion in a rat hind-limb ischemia model.J Endovasc Ther.2005；12：469-478

［11］Peng D，Zuo H，Liu Z，et al.The tetraspanin CD151-ARSA mutant inhibits angiogenesis via the YRSL sequence.Mol Med Rep；7（3）：836-842

［12］Zhang XA，Kazarov AR，Yang X，et al.Function of the tetraspanin CD151-alpha6beta1 integrin complex during cellular morphogenesis.Mol Biol Cell.2002；13（1）：1-11

［13］Yá?ez-Mó M，Alfranca A，Caba?as C，et al.Regulation of endothelial cell motility by complexes of tetraspan molecules CD81／TAPA-1 and CD151／PETA-3 with alpha3 beta1 integrin localized atendothelial lateral junctions.J Cell Biol.1998；141（3）：791-804

［14］Takeda Y，Kazarov AR，Butterfield CE，et al.Deletion of tetraspanin Cd151 results in decreased pathologic angiogenesis in vivo and in vitro.Blood.2007；109（4）：1524-1532

［15］許富英，羅望翠，曾和松，等.整合素β1在CD151促HUVEC遷移增殖中的機制研究.中國組織化學與細胞化學雜志.2010；19（2）：113-117

［16］Zhang F，Michaelson JE，Moshiach S，et al.Tetraspanin CD151 maintains vascular stability by balancing the forces of cell adhesion and cytoskeletal tension.Blood.2011；118（15）：4274-4284

［17］Zheng ZZ，Liu ZX.Activation of the phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinase Akt pathway mediates CD151-induced endothelial cell proliferation and cell migration.Int J Biochem Cell Biol.2007；39：340-348

［18］Sawada S，Yoshimoto M，Odintsova E，et al.The tetraspanin CD151 functions as a negative regulator in the adhesion-dependent activation of Ras.J Biol Chem.2003；278：26323-26326

CD151 promotes angiogenesis through the activation of ERK in vitro

Shen Xiaoqing，Yan Xiuting，Zuo Houjuan，Liu Zhengxiang，F(xiàn)ei Yujie，Liu Zhaoyu*.
（Department of Cardiology，TongJi Hospital，TongJi Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Objective To assess the roles of extracellular signal-regulated kinase（ERK）and p38 mitogen-activated protein kinase（MAPK）in the CD151-induced capillary-like tube formation of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）.Methods CD151，anti-CD151 and GFP were constructed into the recombinant adeno-associated virus（rAAV）vector and used to transfect HUVECs.After transfection，the expression of CD151 was measured.Tube formation was examined on matrigel.The potential involvement of p38MAPK and ERK signaling pathways was explored using ERK or p38 MAPK inhibitors.Results In the CD151 group，compared with the control and GFP groups，capillary-like tube formation in vitro was significantly promoted，while in the antiCD151 group it was significantly inhibited.The overexpressions of CD151 promoted the phosphorylation of ERK and increased the vitality of ERK，but not the phospho-p38 MAPK.Furthermore，CD151-induced capillary-like tube formation on matrigel was attenuated by the ERK inhibitor but not by the p38 inhibitor.Conclusion CD151 promotes capillary-like tube formation in vitro by activating the ERK signaling pathway，but not the p38MAPK signaling pathway.

CD151；Angiogenesis；Mitogen-activated protein kinase，MAPK；Extracellular signal-regulated kinase，ERK

Q463

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.001

2015-05-25

2015-07-02

國家自然科學基金項目資助（81000047）

沈小清，女（1963年），漢族，副主任護師

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：zhaoyuliu－33＠hotmail.com