茶皂素對奶牛乳腺上皮細胞增殖及乳脂合成關(guān)鍵酶的影響

嚴淑紅 邢文麗 方洛云 王俊杰 劉續(xù)航 蔣林樹

(奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206)

隨著生活水平的不斷提高及營養(yǎng)科學研究的進步，人們對牛奶的品質(zhì)要求也越來越高。乳脂是牛奶中的重要組成部分，也是牛奶品質(zhì)重要衡量指標之一，與其他固體成分(乳蛋白和乳糖)相比，乳脂的含量易受飼糧調(diào)控而發(fā)生改變［1］。在奶牛飼糧中添加調(diào)節(jié)劑可調(diào)控乳脂含量，但是化學藥物和抗生素的殘留問題一直困擾著乳產(chǎn)品的安全，研究開發(fā)新型、安全、綠色飼料添加劑代替化學添加劑成為一種必然趨勢。

植物提取物具有天然性、殘留少、綠色環(huán)保等特點，已經(jīng)成為畜牧養(yǎng)殖和科研機構(gòu)研究的重點。茶皂素，又稱油茶皂苷，是一種從山茶科植物中提取的五環(huán)三萜類植物皂苷總稱［2］，由7種配基、4種糖體和2種有機羧酸組成，主要存在于茶種子和茶葉中［3］。茶皂素在抗氧化、抗?jié)B消炎、抑菌、抗溶血等方面都能發(fā)揮作用［4］。茶皂素不僅是一種天然的表面活性劑而且具有廣泛的生物活性作用，還可用作反芻動物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，改善動物生產(chǎn)性能［5］。葉均安等［6］研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)底物中分別添加0.25%、0.50%和1.00%茶皂素，瘤胃原蟲生長受到可不同程度的抑制，瘤胃發(fā)酵狀況得到改善。來海良等［7］報道在瘤胃液體外培養(yǎng)物中添加茶皂素可抑制瘤胃原蟲的數(shù)量增加，增加瘤胃微生物的數(shù)量，使瘤胃發(fā)酵合成微生物蛋白的產(chǎn)量增多。苑文珠［8］研究證明，體外培養(yǎng)的條件下添加茶皂素提高了瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量，總揮發(fā)性脂肪酸及乙酸、丙酸、丁酸的產(chǎn)量增加。彭春雨等［9］研究報道，在奶牛飼糧中添加茶皂素和植物蛻皮甾酮可提高產(chǎn)奶量，但對乳脂率、乳料比和血液生化指標均無顯著影響，分析其原因可能與添加劑量少有關(guān)。在蛋白質(zhì)水平與分子水平上，關(guān)于茶皂素對乳腺上皮細胞合成乳脂的影響研究還鮮見報道，本試驗?zāi)康脑谟谕ㄟ^研究茶皂素對奶牛乳腺上皮細胞增殖及乳脂合成關(guān)鍵酶含量和基因表達的影響，探究茶皂素對奶牛乳腺合成乳脂的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

茶皂素購自浙江東方茶葉有限公司常山分公司，皂甙含量≥95%。

選用1頭體況良好體重約550 kg，年齡為4歲2胎、泌乳期為100 d、日均產(chǎn)奶量約30 kg/d的荷斯坦奶牛作為試驗動物，由北京市順義區(qū)中地畜牧科技有限公司提供。

1.1.2 試驗動物取材

常規(guī)麻醉，在乳房基部至乳頭連線中央切開長約5 cm的切口，采取1 g左右的乳腺組織，置于事先準備好的DMEM/F－12完全培養(yǎng)液(30%胎牛血清、300 IU/mL青霉素、300 IU/mL鏈霉素)中，帶回實驗室做進一步處理，方法參照文獻［10］，采用胰蛋白酶、膠原酶消化液分離獲取乳腺上皮細胞，該方法時間短，得到細胞純度高［11］。

1.2 試驗設(shè)計

將茶皂素用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成不同濃度梯度的儲存液，于－20℃保存?zhèn)溆?，使用前?%DMEM/F-12維持培養(yǎng)液進行稀釋，使其終濃度分別為 0(對照)、0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00μg/mL，收集處于對數(shù)期的乳腺上皮細胞，調(diào)整細胞懸液濃度使乳腺上皮細胞密度為100～10 000個/孔，加入不同濃度梯度的茶皂素溶液，每個濃度梯度設(shè)5個重復(fù);37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24、48、72 h后，檢測乳腺上皮細胞增殖狀況;根據(jù)細胞增殖測定結(jié)果，修正茶皂素溶液濃度梯度為 0、0.50、5.00、20.00 μg/mL，選取同一代的生長性能良好的乳腺上皮細胞，添加不同濃度茶皂素溶液培養(yǎng)。每瓶加3 mL茶皂素溶液，每組設(shè)3個重復(fù)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，消化細胞，測細胞中乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)的含量;每個濃度梯度設(shè)3個重復(fù)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4、24、48 h后，采用實時熒光定量PCR，以β肌動蛋白(β-actin)為參照基因，測定目的基因SCD、ACACA、FASN基因mRNA相對表達水平。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 乳腺上皮細胞鑒定

在6孔細胞培養(yǎng)板中，加入一塊蓋玻片，讓玻片與板底完好接觸，在蓋玻片的中央滴加消化好的細胞懸液，于30℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至80%左右時棄培養(yǎng)液，取出蓋玻片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次3 min;－20℃在甲醇∶丙酮(1∶1)中于4℃固定5 min后，快速用PBS洗滌;用羊血清封閉液常溫孵育15 min;用PBS清洗3次，每次3 min;加入抗角蛋白18一抗120μL(1∶100)，置濕盒中4℃過夜，再次用PBS洗滌;加入二抗［異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗小鼠］120μL(1∶100)于室溫避光孵育1 h，用PBS洗清3次，每次3 min;將1滴抗熒光猝滅劑滴于培養(yǎng)板上，封固，陰性對照用PBS代替一抗;在倒置數(shù)碼熒光顯微鏡下觀察角蛋白18的特異性表達，并拍照［12］。乳腺上皮細胞鑒定方法參照文獻［13］。

1.3.2 乳腺上皮細胞增殖

噻唑藍(MTT)法檢測茶皂素對奶牛乳腺上皮細胞數(shù)量的影響。

1.3.3 乳脂合成關(guān)鍵酶含量

用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒測定細胞內(nèi)SCD、ACACA、FASN 的含量。

1.3.4 乳脂合成關(guān)鍵酶基因mRNA相對表達水平

采用相對定量的方法，以β-actin參照基因，測定目的基因mRNA相對表達水平。根據(jù)實時熒光定量PCR引物設(shè)計原則，使用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計引物(表1)，并由上海生物工程股份有限公司合成。實時熒光定量PCR程序參照BrilliantⅢUltra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix試劑盒進行。溶解曲線均為單一峰值。根據(jù)實時熒光定量 PCR原始檢測結(jié)果，采用2－ΔΔCt相對定量計算公式分析細胞內(nèi)SCD、ACACA、FASN基因mRNA相對表達水平。計算公式如下:

表1 實時熒光定量PCR引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters for fluorescence－based quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel整理試驗數(shù)據(jù)，采用相對定量2－ΔΔCt法對試驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)計算和整理。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的one-way ANOVA進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行平均值的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 乳腺上皮細胞培養(yǎng)及鑒定

本試驗采用時間短、純度高的酶消化法分離培養(yǎng)乳腺上皮細胞，得到的原代細胞呈放射狀生長，純化3代后獲得純度95%以上的乳腺上皮細胞，培養(yǎng)過程中上皮細胞呈鋪路石樣，如圖1所示。

采用上皮細胞特征性物質(zhì)角蛋白18對純化后的細胞進行鑒定，角蛋白18能與FITC標記的二抗結(jié)合而使細胞質(zhì)著色。在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光，說明所培養(yǎng)的細胞為乳腺上皮細胞，而不加一抗的陰性對照組則不顯熒光，如圖2所示。

2.2 茶皂素對奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響

由圖3可知，茶皂素對奶牛乳腺上皮細胞的增殖具有抑制作用。茶皂素與細胞共育24 h后，0～10.00μg/mL茶皂素濃度組乳腺上皮細胞數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，與0μg/mL茶皂素濃度組相比，從20.00μg/mL茶皂素濃度組開始會極顯著抑制細胞增殖(P＜0.01);茶皂素與細胞共育48 h后，0～20.00μg/mL茶皂素濃度組乳腺上皮細胞數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，與0μg/mL組相比，從40.00μg/mL茶皂素濃度組開始會極顯著抑制細胞增殖(P＜0.01);茶皂素與細胞共育72 h后，0～5.00μg/mL茶皂素濃度組乳腺上皮細胞數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，與0μg/mL組相比，從10.00μg/mL茶皂素濃度組開始會極顯著抑制乳腺上皮細胞增殖(P＜0.01)。鑒于茶皂素會不同程度抑制乳腺上皮細胞的增殖，所以，選用低劑量茶皂素濃度組，即對細胞增殖影響不顯著的試驗組進行后續(xù)試驗，即 0、0.50、5.00、20.00 μg/mL茶皂素濃度梯度組。

圖1 原代乳腺上皮細胞Fig.1 Primary mammary epithelial cells

2.3 茶皂素對乳脂合成關(guān)鍵酶的影響

由表2可見，茶皂素與乳腺上皮細胞共育36 h后，各組ACACA、FASN、SCD含量均無顯著差異(P＞0.05)。其中，與對照組相比，ACACA 含量0.5、5.0、20.00 μg/mL 茶皂素濃度組有一定程度的上 升;與 對 照 組 相 比，F(xiàn)ASN 含 量 0.50、5.00μg/mL茶皂素濃度組表現(xiàn)上升趨勢，而在20.00μg/mL茶皂素濃度組表現(xiàn)下降趨勢;SCD含量在0.50、5.00、20.00μg/mL茶皂素濃度組與 對照組相比均呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 角蛋白18結(jié)合的乳腺上皮細胞Fig.2 Mammary epithelial cells combined with keratin 18

圖3 茶皂素對乳腺上皮細胞增殖的影響Fig.3 Effects of tea saponin on mammary epithelial cell proliferation

表2 茶皂素濃度對乳腺上皮細胞SCD、ACACA、FASN含量的影響Table 2 Effects of tea saponin on SCD，ACACA and FASN contents in mammary epithelial cell μg/mL

由表3可見，乳腺上皮細胞與茶皂素共育4、24、48 h后，各組ACACA基因mRNA相對表達水平差異不顯著(P ＞0.05)，其中，24 h時在 0.50、5.00μg/mL茶 皂 素 濃 度 組 有 所 下 降，但 在20.00μg/mL茶皂素濃度組又有所回升。由表4可見，乳腺上皮細胞與茶皂素共育4、24、48 h后，各組FASN基因mRNA相對表達水平差異不顯著(P ＞0.05)，其中，共育 4 h后，基因mRNA相對表達水平有所提高，之后表現(xiàn)下降趨勢。由表5可見，乳腺上皮細胞與茶皂素共育4、24、48 h后，與對照組相比，SCD基因mRNA相對表達水平在茶皂素濃度為0.50、5.00、20.00 μg/mL 時受茶皂素的抑制作用顯著(P＜0.05)，其基因mRNA相對表達水平在 24 h 后分別下調(diào)到 0.17、0.05、0.12，48 h 后分別下調(diào)到 0.08、0.05、0.18。

表3 茶皂素對乳腺上皮細胞ACACA基因mRNA相對表達水平的影響Table 3 Effects of tea saponin on the relative expression level of ACACA mRNA in mammary epithelial cell

表4 茶皂素對乳腺上皮細胞FASN基因mRNA相對表達水平的影響Table 4 Effects of tea saponin on the relative expression level of FASN mRNA in mammary epithelial cell

表5 茶皂素對乳腺上皮細胞SCD基因mRNA相對表達水平的影響Table 5 Effects of tea saponin on the relative expression level of SCD mRNA in mammary epithelial cell

3 討論

3.1 茶皂素對乳腺上皮細胞增殖的影響

乳腺上皮細胞是乳脂的合成場所，乳腺上皮細胞正常的生命周期活動是分泌乳脂的前提保證。細胞增殖是指通過細胞分裂增加細胞數(shù)量，它既是生物繁殖的根本途徑，又是維持細胞數(shù)量平衡和機體正常功能所必需的基礎(chǔ)條件。而細胞凋亡(apoptosis)是指死亡信號誘發(fā)細胞凋亡的過程，是細胞生理性死亡的普遍形式［14］。各種細胞內(nèi)因素及機體外界因素如化學物質(zhì)作用、溫度變化、pH變化等都會對細胞周期產(chǎn)生重要影響，從而影響細胞的增殖與調(diào)亡。朱麗麗等［15］的研究結(jié)果表明重樓皂甙能夠抑制SGC-7901細胞的增殖。吳葆華等［16］研究結(jié)果同樣表明桔梗皂苷D對人結(jié)腸癌SW620細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。彭春燕［17］研究結(jié)果顯示100和200μg/mL濃度組的桔梗總皂苷相對空白組存在顯著性差異，能夠顯著抑制山羊乳腺上皮細胞的增殖。這些研究均與本試驗的研究結(jié)果相似。

本試驗通過MTT法檢測茶皂素對乳腺上皮細胞增殖的影響，結(jié)果顯示茶皂素與乳腺上皮細胞共育24 h后，從20.00μg/mL茶皂素濃度組開始會極顯著地抑制細胞增殖;茶皂素與細胞共育48 h后，從40.00μg/mL茶皂素濃度組開始會極顯著地抑制細胞增殖;茶皂素與細胞共育72 h后，從10.00μg/mL茶皂素濃度組開始會極顯著地抑制細胞增殖。從試驗結(jié)果可以看出，乳腺上皮細胞與茶皂素共育的時間越長，茶皂素開始對乳腺上皮細胞增殖產(chǎn)生顯著抑制的濃度越低，分析原因可能是茶皂素作用于乳腺上皮細胞可能有一定過程，但是具體的作用機制尚不清楚。本試驗探究與分析了茶皂素對乳腺上皮細胞增殖的影響規(guī)律，同時可為進一步研究茶皂素對乳脂合成的影響提供濃度選擇的試驗依據(jù)。

3.2 茶皂素對乳脂合成關(guān)鍵酶含量和基因表達的影響

牛乳脂主要由是甘油三酯(triglyceride，TG)構(gòu)成，而機體合成甘油三酯主要有2條途徑:乳腺上皮細胞以乙酰輔酶A為原料從頭合成全部的C14脂肪酸和1/2的C16脂肪酸;C18以上的長鏈脂肪酸全部是由乳腺上皮細胞從血液中吸收的［18］。ACACA、FASN、SCD 是乳脂合成中的重要酶系，其中，ACACA、FASN主要對脂肪酸從頭合成起作用，而脂蛋白酯酶則主要對從血液中攝取發(fā)揮作用，SCD同時調(diào)節(jié)以上2條途徑［19］。目前，關(guān)于茶皂素對乳脂合成作用的研究比較少，茅慧玲等［20］的研究結(jié)果表明飼糧中添加茶皂素可以顯著降低肌肉中飽和脂肪酸的含量，而對不飽和脂肪酸含量有增加趨勢，但未達到顯著水平。王延芳［21］試驗結(jié)果也表明油茶皂素可控制高脂小鼠的體重，驗證了油茶皂素的減肥作用，油茶皂素堿水解產(chǎn)物和酸水解產(chǎn)物明顯降低血清中的膽固醇含量。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)水平上，上述3種酶受茶皂素調(diào)控的作用不顯著，除ACACA含量有一定程度的上調(diào)外，其余基本呈下降趨勢。而在基因水平上，SCD基因mRNA相對表達水平在0.50、5.00、20.00 μg/mL 茶皂素濃度組時出現(xiàn)顯著下降。這說明茶皂素對奶牛乳脂合成關(guān)鍵酶基因mRNA相對表達水平的影響隨著其濃度、作用時間及酶基因的不同而有所變化，一定范圍內(nèi)具有抑制作用。

茶皂素廣泛存在于茶葉、茶籽中，而我國自古以來就是茶葉大國，因此具有巨大的茶皂素資源，雖然茶皂素作為表面活性劑和生物活性劑在農(nóng)業(yè)［22］、工業(yè)［23］、漁業(yè)養(yǎng)殖［24］等有一定的應(yīng)用，但是尚未得到充分開發(fā)利用。周奕毅［25］、Hu等［26］研究報道茶皂素可作為反芻動物瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，影響瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，改善瘤胃微生物發(fā)酵，提高飼糧蛋白質(zhì)利用率，降低甲烷產(chǎn)量，提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善反芻動物生產(chǎn)性能。牛奶生物活性脂肪酸研究方面揭示瘤胃和乳腺對脂肪酸合成具有協(xié)同機制［27］，但茶皂素對這種協(xié)同機制的影響，目前尚不清楚。本試驗研究發(fā)現(xiàn)茶皂素能在一定程度上可抑制乳腺上皮細胞的增殖和乳脂合成關(guān)鍵酶基因的表達，為解決低脂乳品和化學添加劑殘留問題提供了新的解決思路，同時為進一步研究茶皂素作為調(diào)控奶牛生產(chǎn)性能與牛乳品質(zhì)的天然飼料添加劑提供了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

茶皂素對乳腺上皮細胞增殖具有抑制作用，但具有濃度依賴性，同時受到作用時間的影響;茶皂素一定程度上可顯著抑制乳脂合成關(guān)鍵酶SCD基因mRNA相對表達水平，而對ACACA、FASN基因mRNA相對表達水平無顯著影響。

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