妊娠后期母豬飼糧中添加殼寡糖對(duì)新生仔豬抗氧化能力的影響

龍次民 謝春艷 吳 信* 范志勇 劉紅南 印遇龍*肖定福 張 彬 謝正軍 王勇飛

(1.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 410125;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128;3.雙胞胎(集團(tuán))股份有限公司，南昌 330000)

殼寡糖(chito-oligosaccharide，COS)學(xué)名為β-1，4-寡聚-葡萄糖胺。COS分子帶有活性氨基基團(tuán)，而且可被動(dòng)物直接吸收入血作用于靶細(xì)胞，在提高機(jī)體抗氧化能力方面發(fā)揮著重要作用［1］。COS 可被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞［2］，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和活性氮氧化物［3］。金黎明等［4］發(fā)現(xiàn)，COS可降低小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和肝臟組織中的丙二醛(MDA)含量，保護(hù)肝臟不受四氯化碳的損傷，提高肝臟抗氧化力;Liu等［5］發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中添加COS，能增加其超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性，抑制過(guò)氧化氫生成活性氧。另外，COS可絡(luò)合金屬離子，形成重金屬-大分子復(fù)合物，抑制由金屬離子催化的氧化性損傷以及羥自由基的產(chǎn)生［6-7］。

妊娠期動(dòng)物機(jī)體代謝途徑與非妊娠狀態(tài)有所不同，這種差異隨妊娠進(jìn)程表現(xiàn)更為明顯。妊娠后期，胎兒的迅速發(fā)育對(duì)氧氣與養(yǎng)分需求增加迅速，對(duì)母體造成嚴(yán)重的代謝負(fù)擔(dān)［8］，更容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激［9-10］，而產(chǎn)生的自由基可損傷胎盤(pán)絨毛，導(dǎo)致絨毛細(xì)胞膜、線粒體膜和胎盤(pán)功能異常，影響胎兒在子宮內(nèi)的發(fā)育［11］。此外，應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷還會(huì)造成母豬泌乳性能和機(jī)體免疫機(jī)能下降，嚴(yán)重影響母豬自身健康、利用年限及其子代發(fā)育［12-14］。因此，抗氧化損傷修復(fù)措施的合理選擇對(duì)繁殖母豬意義十分突出。本試驗(yàn)研究通過(guò)妊娠后期母豬飼糧中添加COS，以考察COS對(duì)母豬及新生仔豬抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

COS為水溶性COS，聚合度在2～10之間，以3～4糖為主，分子質(zhì)量≤2 000 u，純度為10%，由中泰和(北京)科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇體重接近(185 kg左右)、胎次接近(3～5胎)、預(yù)產(chǎn)期一致和與配公豬一致的健康“長(zhǎng)×白”二元雜母豬16頭，隨機(jī)分為2組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭母豬。對(duì)照組飼喂的基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1998)推薦的哺乳母豬飼糧營(yíng)養(yǎng)水平設(shè)計(jì)配方，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1;COS組在基礎(chǔ)飼糧上添加30 g/t的COS(按10%純度COS折算成純品的添加量)，每天08:30及15:00飼喂2次，每頭母豬投料量在1.8 kg/d左右。試驗(yàn)從母豬妊娠85 d開(kāi)始至產(chǎn)仔結(jié)束，在江西雙胞胎集團(tuán)贛州安遠(yuǎn)金塘原種豬場(chǎng)進(jìn)行，嚴(yán)格按照豬場(chǎng)防疫和飼養(yǎng)管理制度進(jìn)行操作。

1.3 樣品采集及指標(biāo)檢測(cè)

記錄母豬產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)(體重大于800 g)、初生個(gè)體重、窩重、產(chǎn)程(首個(gè)仔豬產(chǎn)出到胎盤(pán)排出的時(shí)間間隔)。

妊娠110 d前腔靜脈采血10 mL，仔豬出生后，于其吃奶前每窩隨機(jī)選擇1頭與窩平均體重相近(1.60±0.04)kg的仔豬，前腔靜脈采血5 mL，加肝素鈉，輕輕混勻，室溫靜置30 min后離心收集血漿。采用比色法檢測(cè)血液中總超氧化物歧化酶(TSOD)、GSH-Px、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及MDA含量，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

將采血后的仔豬屠宰，采集肝臟、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸，以1.5 mL EP管裝好，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中保存。

表1 飼糧基礎(chǔ)組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

采用Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))法提取組織中總 RNA，具體操作方法參照 Simms等［15］，然后將RNA濃度調(diào)節(jié)一致，取100 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(日本)，具體方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，再利用Real-time PCR法檢測(cè)組織中錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPX1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)基因的相對(duì)表達(dá)量，基因的引物設(shè)計(jì)如表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列Table 2 Primer sequence of real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后，運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤(ˉX ±SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對(duì)母豬繁殖性能的影響

由表3可知，妊娠后期母豬飼糧中添加COS對(duì)母豬繁殖性能沒(méi)有顯著的影響(P＞0.05)，但是在一定程度上可以縮短母豬產(chǎn)程。

表3 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對(duì)母豬繁殖性能的影響Table 3 Effects of dietary COS in late-gestation sows on reproductive performance of sows(n=8)

2.2 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對(duì)母豬血液抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，妊娠后期母豬飼糧中添加COS顯著提高了血液中TSOD活性(P＜0.05)，并有降低MDA含量的趨勢(shì)(P＞0.05)，但對(duì)GSH-Px及CAT活性無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

2.3 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對(duì)仔豬血液抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，妊娠后期母豬飼糧中添加COS顯著提高了新生仔豬血液中GSH-Px、CAT活性(P＜0.05)，并有降低 MDA含量的趨勢(shì)(P＞0.05)，而新生仔豬血液中TSOD活性差異不顯著(P ＞0.05)。

2.4 仔豬組織中抗氧化基因的表達(dá)

由圖1至圖5可知，妊娠后期母豬飼糧中添加COS增加了新生仔豬抗氧化基因GPX1在十二指腸及結(jié)腸中的相對(duì)表達(dá)量，顯著了降低了GPX1在空腸中的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05);GPX4在空腸中相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)，且在回腸中的相對(duì)表達(dá)量有上升趨勢(shì)(P＞0.05)，與血液中GSH-Px活性的變化一致。Mn-SOD和CuZn-SOD的相對(duì)表達(dá)量2組之間均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05);COS組CAT的相對(duì)表達(dá)量在回腸中顯著升高(P＜0.05)，且在肝臟中相對(duì)表達(dá)量有上升的趨勢(shì)(P＜0.05)，與新生仔豬血液中CAT活性變化規(guī)律一致。

表4 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對(duì)母豬血液抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary COS in late-gestation sows on blood antioxidant indicators of sows(n=8)

表5 妊娠后期母豬飼糧中添加COS對(duì)新生仔豬血液抗氧化力的影響Table 5 Effects of dietary COS in late-gestation sows on blood antioxidant indicators of piglets(n=8)

圖1 GPX1在初生仔豬各組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression of GPX1 in tissues of piglets

圖4 CuZn-SOD在仔豬各組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression of CuZn-SOD in tissues of piglets

圖5 CAT在初生仔豬各組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relative expression of CAT in tissues of piglets

3 討論

機(jī)體應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的自由基具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體組織與細(xì)胞，可使機(jī)體內(nèi)大分子蛋白質(zhì)氧化生成其他自由基(如蛋白質(zhì)-過(guò)氧羥自由基)和蛋白質(zhì)氧化性產(chǎn)物，如造成蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈中氧化性氨基酸的生成、蛋白質(zhì)片斷化、氨基酸或者蛋白質(zhì)的亞硝基化以及蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物的生成［16］。羥自由基亦可與核苷酸堿基和脫氧核糖鏈直接反應(yīng)，形成大量修飾化堿基，其中8-羥基鳥(niǎo)嘌呤(8-OHdG)是堿基主要的損傷形式［17］。另外，自由基與細(xì)胞膜系統(tǒng)中的一些不飽和脂肪酸結(jié)合，加劇脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，生成反應(yīng)活性很高的醛類(lèi)(如MDA)，這些醛類(lèi)會(huì)與核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)交聯(lián)聚合，引起基因突變［1］。

COS是一種具有抗氧化作用的功能性添加劑，研究發(fā)現(xiàn)，COS能減少機(jī)體自由基的數(shù)量。Sun等［18］的體外研究表明，COS對(duì)細(xì)胞中超氧陰離子有較好的清除作用，其能力甚至與維生素C、SOD的作用相當(dāng);另外一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)COS對(duì)羥自由基［19］、1，1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼(DPPH)［20］自由基亦有較好的清除效果，并且清除作用會(huì)隨著COS濃度升高而增強(qiáng)。在本研究中，母豬和仔豬血液中MDA含量均有不同程度下降，而MDA是機(jī)體內(nèi)自由基攻擊細(xì)胞膜后脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物［21］，其含量可間接反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［22］，說(shuō)明妊娠后期母豬飼糧中添加COS能減少機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生。

此外，飼糧中添加COS具有提高機(jī)體抗氧化酶活性的作用，Yoon等［23］通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，COS具有緩解急性腎衰竭引起的抗氧化酶活性下降的作用。Liu等［5］發(fā)現(xiàn)，利用 COS干預(yù)由過(guò)氧化氫引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化損傷模型，能有效提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、一氧化氮(NO)等抗氧化酶的活性。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，COS能緩解糖尿?。?4］、肝損傷［25］模型中抗氧化酶下降的現(xiàn)象，提高機(jī)體SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性。本研究中，妊娠后期母豬飼糧中添加COS使妊娠后期血液中TSOD活性上升了17.4%，MDA含量下降了40.6%，證明COS對(duì)母豬的抗氧化能力具有一定的改善作用。胎兒在母體內(nèi)通過(guò)胎盤(pán)與母體進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、氣體、生物活性物質(zhì)等的交換，胎盤(pán)通過(guò)血液循環(huán)以滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要［26］，且胎盤(pán)則可以通過(guò)形態(tài)和功能的變化來(lái)適應(yīng)胎兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷需求［27］，因此母體的營(yíng)養(yǎng)水平及健康狀況直接影響孕期胎兒的發(fā)育。在本研究中，妊娠后期母豬飼糧中添加COS使新生仔豬血液中GSH-Px活性顯著上升，提高了其組織中調(diào)控基因GPX4相對(duì)表達(dá)量，然而在仔豬空腸中，COS組GPX1相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，而GPX4是物種生存所必需的，被敲除后會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡［28-29］，這說(shuō)明GPX4對(duì)整個(gè)抗氧化系統(tǒng)起到?jīng)Q定性作用，另外，Malandrakis等［30］對(duì)金頭鯛的急性應(yīng)激試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GPX1與GPX4出現(xiàn)相反的表達(dá)規(guī)律;COS亦提高了仔豬血液中CAT活性及基因相對(duì)表達(dá)量;但2個(gè)處理之間新生仔豬體內(nèi)SOD活性及基因相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。GSH-Px、SOD、CAT為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，在機(jī)體自由基清除上發(fā)揮著重要作用，其活性直接反映出機(jī)體的抗氧化能力［31］。表明妊娠后期母豬飼糧中添加COS可提高新生仔豬抗氧化能力。

4 結(jié)論

妊娠后期(85 d至產(chǎn)仔)母豬飼糧中添加30 g/t COS可能通過(guò)提高母豬抗氧化酶活性縮短母豬產(chǎn)程，從而影響母豬的繁殖能力;同時(shí)，還可提高新生仔豬體內(nèi)抗氧化酶活性及其上游調(diào)控基因的表達(dá)，提高仔豬抗氧化力。

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