共軛亞油酸和α-亞麻酸對HepG2細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶A1表達(dá)的影響

李廣亮 張秀英 齊 悅 郝麗紅 張金銘

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

共軛亞油酸(CLA)和α-亞麻酸(ALA)分別是多不飽和脂肪酸(PUFA)中n-6家族和n-3家族的重要代表，是人和動物不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，在食品和飼料中保持適量的CLA和ALA能夠有效預(yù)防和抑制代謝綜合征及其引發(fā)的多種疾?。?-3］。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)是可誘導(dǎo)多種解毒酶、生物轉(zhuǎn)化酶和異生物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子［4-5］，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是Nrf2信號通路下游的靶基因，其中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)是Ⅱ相代謝酶GSTs酶系重要亞型，占胞液總GSTs的65% ～75%，是細(xì)胞防御系統(tǒng)重要的組成部分。因此研究CLA和ALA與Nrf2和GSTA1的相關(guān)性具有重要意義［6］。研究證明，Nrf2具有抗氧化和抗炎癥等功能，被認(rèn)為是能夠治療多種代謝綜合征引起的疾病的潛在藥物作用靶點(diǎn)［7］，而在雞和家兔的飼料中添加2種脂肪酸均發(fā)現(xiàn)會提高雞蛋和家兔肝臟中Nrf2的表達(dá)量［8-9］。但對于不同濃度的 CLA和 ALA作用HepG2細(xì)胞時，對Nrf2-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)信號通路以及GSTA1表達(dá)量的影響，鮮有詳細(xì)報(bào)道。鑒于此，本文旨在探討CLA和ALA以不同的濃度作用HepG2細(xì)胞24 h時，對HepG2細(xì)胞中Nrf2和GSTA1的mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

HepG2細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈送;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司;CLA和ALA購自Sigma公司;RT-PCR試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司;Trizol購自Invitrogen公司;人源細(xì)胞Nrf2抗體購自Immunoway公司;GSTA1抗體購自武漢三鷹公司;辣根過氧化物標(biāo)記羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和RIPA裂解液均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 mL培養(yǎng)瓶，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。使用0.25%的胰蛋白酶消化，將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞生長穩(wěn)定、細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時，將皂化后的CLA和ALA加入培養(yǎng)基至所需濃度。分別添加0.2、0.5和1.0 mmol/L CLA，0.2、0.5 和 1.0 mmol/L ALA，作用24 h，每個處理6個重復(fù)，并設(shè)空白對照組。

1.2.2 噻唑藍(lán)(MTT)試驗(yàn)

將細(xì)胞接種于96孔板，待其長成單層后棄掉原有培養(yǎng)液，加入稀釋后的CLA和ALA培養(yǎng)液，濃度梯度分別是 0、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0 和5.0 mmol/L。每梯度平行接種12個孔，同時設(shè)對照孔。每孔加入100μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入10μL的MTT，培養(yǎng)4 h，加入100μL二甲基亞砜(DMSO)溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測，計(jì)算細(xì)胞成活率。

細(xì)胞成活率(%)=100×樣品孔吸光度值/對照孔吸光度值。

1.2.3 總 RNA提取和 RT-PCR檢測 Nrf2和GSTA1的mRNA表達(dá)量

用TRIzol(Invitrogen)法提取HepG2細(xì)胞中總RNA，立刻使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光定量PCR儀(ABI 7500 RT-PCR SDS system)定量。通過SYBR Green熒光定量染料法，反應(yīng)條件設(shè)置為94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火34 s，循環(huán)次數(shù)40次。使用引物如下，Nrf2的上游引物:5’-TTCCCGGTCACATCGAGAG-3’，下游引物:5’-TCCTGTTGCATACCGTCTAAATC-3’;GSTA1的上游引物:5’-GGGAAAGACATA AAGGAGAGAG-3’，下游引物:5’-TCAAAGGCAGGGAAGTAGC-3’;β -肌動蛋白(β-actin)的上游引物:5’-GATCCACATCAGCTGGGAAGG-3’，下游引物:5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’。

1.2.4 蛋白質(zhì)的提取以及蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測Nrf2和GSTA1的蛋白質(zhì)表達(dá)量

采用RIPA裂解法，提取細(xì)胞總蛋白。將棄掉培養(yǎng)液的細(xì)胞，用滅菌處理的冰PBS沖洗1～2次，加入80μL RIPA裂解液(碧云天試劑公司)用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，并吸取進(jìn)離心管中，14 000×g離心30 min，吸取上層清液備用，以上提取蛋白質(zhì)操作都在冰上操作，以防止在提取過程中蛋白質(zhì)降解，通過紫外分光光度法和BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同且合適的濃度進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)電泳(電泳時間:100 V、2 h;100 V、40 min)。濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(NC)膜(轉(zhuǎn)膜時間:100 V、2 h)，用三乙醇胺緩沖鹽(TBST)溶液稀釋的終濃度為5%的脫脂乳封閉1 h，用兔抗人Nrf2抗體(1∶1 000)孵育4℃過夜。然后用羊抗兔二抗室溫封閉1 h，采用電化學(xué)發(fā)光檢測法(ECL法)顯色。同一樣本用β-actin作為內(nèi)參。結(jié)果用Image J凝膠分析軟件進(jìn)行吸光度值分析。每個結(jié)果至少經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)得到。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的 CLA和 ALA對 Hep G2細(xì)胞成活率的影響

由表1可知，不同濃度的CLA和 ALA對HepG2細(xì)胞成活率的影響，與對照組相比，CLA和ALA低濃度時對細(xì)胞成活率無顯著影響(P＞0.05)，當(dāng) CLA 和 ALA 的 濃 度 為 3.0 和5.0 mmol/L時，極顯著降低HepG2細(xì)胞的成活率(P＜0.01)。本試驗(yàn)所使用的濃度對細(xì)胞成活率沒有顯著影響(P＞0.05)。

表1 不同濃度的CLA和ALA對HepG2細(xì)胞成活率的影響Table 1 Effects of different CLA and ALA concentrations on survival percentage of HepG2 cells %

2.2 不同濃度的 CLA和 ALA對 Nrf2 mRNA表達(dá)量的影響

由圖1可知，與對照組相比，CLA濃度為0.2和0.5 mmol/L時，Nrf2 mRNA的表達(dá)量分別提高4.53倍和3.39倍，差異極顯著(P ＜0.01);CLA濃度為1.0 mmol/L時，Nrf2 mRNA的表達(dá)量與對照組相比提高1.67倍，差異顯著(P＜0.05)。與對照組相比，ALA濃度為0.2 mmol/L時，Nrf2 mRNA表達(dá)量變化不顯著(P＞0.05);ALA濃度為0.5和1.0 mmol/L時，Nrf2 mRNA表達(dá)量分別提高2.65 倍和8.44 倍，差異極顯著(P ＜0.01)。

2.3 不同濃度的CLA和ALA對GSTA1 mRNA表達(dá)量的影響

由圖2可知，與對照組相比，CLA濃度為0.5和1.0 mmol/L時，GSTA1 mRNA表達(dá)量分別提高4.39倍和 3.35 倍，差異極顯著(P ＜0.01);CLA濃度為0.2 mmol/L時，GSTA1 mRNA表達(dá)量與對照組相比提高1.61倍，差異顯著(P＜0.05)。與對照組相比，ALA濃度為0.2 mmol/L時，GSTA1 mRNA變化不顯著(P ＞0.05)，ALA 濃度為 0.5和1.0 mmol/L時，GSTA1 mRNA表達(dá)量分別提高3.00倍和 4.59 倍，差異極顯著(P ＜0.01)。

2.4 不同濃度的CLA對Nrf2和GSTA1蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

由圖3可知，與對照組相比，CLA濃度為0.2和0.5 mmol/L時，Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)量提高1.85倍和1.91倍，差異極顯著(P＜0.01);CLA 濃度為1.0 mmol/L時，Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)量提高 1.27倍，差異不顯著(P＞0.05)。與對照組相比，CLA濃度為 0.2和0.5 mmol/L時，GSTA1蛋白質(zhì)表達(dá)量分別提高1.93倍和2.05倍，差異極顯著(P＜0.01);CLA 濃度為 1.0 mmol/L 時，GSTA1 蛋白質(zhì)表達(dá)量提高1.53倍，差異顯著(P＜0.05)。

圖1 不同濃度的CLA和ALA對Nrf2 mRNA表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of different CLA and ALA concentrations on expression of Nrf2 mRNA

2.5 不同濃度的ALA對Nrf2和GSTA1蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

由圖4可知，與對照組相比，ALA濃度為0.2 mmol/L時，Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)量提高1.35倍，差異顯著(P＜0.05);ALA濃度為 0.5和1.0 mmol/L時，Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)量分別提高1.77倍和1.94倍，差異極顯著(P＜0.01)。與對照組相比，當(dāng) ALA 濃度分別為0.2、0.5 和1.0 mmol/L時，GSTA1蛋白質(zhì)表達(dá)量分別提高了1.75倍、2.28倍和 2.86 倍，差異極顯著(P ＜0.01)。

圖2 不同濃度CLA和ALA對GSTA1 mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of different CLA and ALA concentrations on expression of GSTA1 mRNA

圖3 不同濃度的CLA對Nrf2和GSTA1蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of different CLA concentrations on protein expression of Nrf2 and GSTA1

3 討論

基因和環(huán)境因素是影響人和動物的健康和疾病的關(guān)鍵因素，營養(yǎng)物質(zhì)是環(huán)境因素中重要的組成部分，而且其變化會影響人和動物的健康和疾?。?0-11］。CLA和ALA是機(jī)體所必需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，2種不飽和脂肪酸對于維持人和動物的健康具有重要作用。目前，對于CLA和ALA的研究，大多數(shù)是進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，研究集中在攝入食物時的比例和血液中的含量等方面，而在細(xì)胞水平上，CLA和ALA對細(xì)胞狀態(tài)的影響和對細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號通路的影響鮮有研究［1，9，12］。

圖4 不同濃度的ALA對Nrf2和GSTA1蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of different ALA concentrations on protein expression of Nrf2 and GSTA1

GSTA1具有降解多種有毒化學(xué)物質(zhì)和調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化平衡的作用，也是Nrf2-Keap1信號通路調(diào)控的下游靶基因之一［6］，Nrf2是信號通路的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，提高Nrf2的表達(dá)量對于機(jī)體具有保護(hù)作用，可治療和預(yù)防人和動物的代謝綜合征和脂肪肝等多種疾病，適量的攝入CLA和ALA，對于保證人和動物的健康至關(guān)重要［12，14］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的CLA和ALA均不同程度上提高了Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量，但提高的量不同。Selene 等報(bào)道［14］，0.4 mmol/L ALA可通過提高HepG2細(xì)胞中Nrf2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量，由此減輕砷引起的細(xì)胞損害;還有研究證明，在飼料中添加ALA可增加家兔腦內(nèi)Nrf2的蛋白質(zhì)表達(dá)量，調(diào)節(jié)腦內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，緩解腦退行性變等多種腦內(nèi)疾?。?5］;并且在威斯塔鼠飼料中添加CLA，同樣會增加Nrf2蛋白質(zhì)的表達(dá)量［11］，這與本試驗(yàn)結(jié)果可相互印證。在本試驗(yàn)選擇的濃度范圍內(nèi)，ALA的濃度越大，Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量提高的越多;而CLA則是在濃度為0.5 mmol/L時，誘導(dǎo) Nrf2和 GSTA1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的作用最強(qiáng)，而CLA濃度為1.0 mmol/L時，提高 Nrf2和 GSTA1的 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量相對減少。ALA和CLA都能增強(qiáng)Nrf2和GSTA1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量，而不同的濃度增強(qiáng)的幅度變化較大。CLA和ALA作為必需脂肪酸，攝入的多少對于機(jī)體的健康非常重要。CLA和ALA在體內(nèi)含量不同時，引起相應(yīng)的生物學(xué)特征改變的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

CLA在較低濃度時，誘導(dǎo) Nrf2和 GSTA1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量作用較強(qiáng)，而隨ALA濃度增加Nrf2和GSTA1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量逐漸增多。

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