飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦生長性能及腸道健康的改善作用

王猛強(qiáng) 黃曉玲 金 敏 霍雅文 黃文文 李 弋 周歧存

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)原產(chǎn)于南太平洋沿岸的暖水水域，分類學(xué)上隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，甲 殼 綱 (Crustacea)，對 蝦 屬(Penaeus)，具有生長迅速、廣鹽性、廣溫性、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)需求低等特點(diǎn)［1］。凡納濱對蝦自1988年引進(jìn)中國大陸，并于20世紀(jì)90年代成功實現(xiàn)了凡納濱對蝦的人工繁育［2］，現(xiàn)已經(jīng)得到大面積推廣，并成為我國三大對蝦的首選養(yǎng)殖品種，也是目前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對蝦品種［3-4］。魚粉因其具有均衡的氨基酸、礦物質(zhì)、維生素及較好的適口性成為水產(chǎn)動物配合飼料的重要組成部分，并且凡納濱對蝦的生長高度依賴于魚粉［5］，在世界范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類中，對蝦養(yǎng)殖消耗的魚粉量最大，占水產(chǎn)飼料消耗魚粉量的24% ～27%［6］，但是魚粉是一種有限資源，從1985年開始魚粉的產(chǎn)量一直穩(wěn)定在700萬t左右［7］，因而成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。為了解決魚粉資源短缺問題，許多研究者尋找合適的原料，如肉骨粉、蠅蛆粉、藻粉、豆粕等，來替代凡納濱對蝦配合飼料中的魚粉，但當(dāng)替代魚粉達(dá)到一定水平后，凡納濱對蝦的生長性能及飼料利用就會受到影響［8-10］，因此尋找一種新的途徑來節(jié)省魚粉的使用具有重要意義。

植物精油是由植物中提取的植物次生產(chǎn)物，能夠被完全降解，不會給環(huán)境和食品安全帶來危害［11］，因其具有抗菌、防腐、殺蟲、抗氧化的作用而被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、衛(wèi)生、化妝等行業(yè)［12-13］。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的規(guī)模化和集約化，水環(huán)境日益惡化，水產(chǎn)動物免疫力下降、疾病頻發(fā)，越來越多的研究人員開始關(guān)注植物性產(chǎn)品的功能，在對鯽魚(Carassius auratus)、軍曹魚(Rachycentron canadum)、鯉魚(Cyprinus carpio)、凡納濱對蝦、大菱鲆(Tarphops oligolepis)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)及大黃魚(Pseudosciaena crocea)的研究中均表明植物精油產(chǎn)品不僅能夠增強(qiáng)水產(chǎn)動物的免疫力，而且對水產(chǎn)動物的腸道菌落結(jié)構(gòu)、肌肉品質(zhì)有一定影響［14-23］，但缺乏其對魚粉節(jié)省效應(yīng)的研究。因此，本試驗擬以25%的魚粉含量為對照，同時設(shè)22%和19%2個低魚粉含量，研究降低魚粉含量的同時添加植物精油對凡納濱對蝦生長性能、體成分、血清生化指標(biāo)及腸道超微結(jié)構(gòu)的影響，以期通過添加植物精油來節(jié)約凡納濱對蝦養(yǎng)殖中魚粉的用量。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配制

以魚粉、豆粕(溶劑浸出法制備)和花生粕為主要蛋白質(zhì)源，魚油、豆油和大豆卵磷脂為主要脂肪源，配制出粗蛋白質(zhì)含量為40%、粗脂肪含量為9%的5種試驗飼料(D1～D5，D1為對照)，試驗飼料中植物精油的添加量分別為0、0、0.02%、0、0.02%，對應(yīng)的魚粉含量依次為25%、22%、22%、19%、19%。植物精油為由百奧明添加劑有限公司提供的PEP-MGE，主要為柑橘油、牛至油等的混合油。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，按照配方將各種固態(tài)原料混合后過80目篩，維生素和礦物質(zhì)等微量組分采用逐級擴(kuò)大法混合，再加入魚油、豆油和大豆卵磷脂以及水混合均勻，用雙螺桿擠條機(jī)壓制成粒徑為1.0和1.5 mm的顆粒飼料，90℃烘箱中熟化30 min，自然風(fēng)干，飼料密封后放入-20℃冰箱中保存，測得各試驗飼料的必需氨基酸組成見表2。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

續(xù)表1

表2 試驗飼料的必需氨基酸組成Table 2 Essential amino acid composition of experimental diets %

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗于廣東恒興飼料集團(tuán)東海島試驗基地進(jìn)行，蝦苗來源于恒興蝦苗場孵化的進(jìn)口1代苗。正式試驗前先將所需蝦苗暫養(yǎng)于室外水泥池(2 m×2 m×1 m)中，待蝦苗長至接近試驗規(guī)格時，將其轉(zhuǎn)入正式試驗的室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)(300 L水體的圓桶形玻璃鋼桶)中繼續(xù)暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間幼蝦根據(jù)蝦苗規(guī)格先后投喂豐年蟲、蝦片、恒興牌凡納濱對蝦開口料及0號料;試驗分組前24 h蝦苗停止喂食，挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格基本一致、初重為(0.33±0.01)g的凡納濱對蝦750尾，隨機(jī)分為5組(每組5個重復(fù)，每個重復(fù)30尾)，分別飼喂1種試驗飼料，試驗期為8周。試驗期間每天于07:00、11:00、17:00和21:00各投喂1次，投喂1 h后觀察對蝦攝食情況，并根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整投喂量。試驗用水為經(jīng)砂濾、沉淀后的海水，連續(xù)充氣，每天記錄水溫，每周測定鹽度、溶解氧濃度及pH。試驗期間水溫為(26.7±1.3)℃，水體pH 為 7.7 ±0.1，鹽度為(19.4 ±1.7)‰，溶解氧濃度 ＞6.0 mg/L，氨氮濃度≤0.05 mg/L。

1.3 樣品采集及分析

試驗結(jié)束后饑餓24 h，稱重并記錄存活尾數(shù)，計算生長性能指標(biāo)。

每桶隨機(jī)取6尾對蝦，保存于-20℃冰箱，用于體成分分析;每桶另隨機(jī)取10尾對蝦，單獨(dú)稱體重后，于第5步足基部血竇取血，盛于1.5 mL離心管中，混合后于4℃冰箱放置過夜后，5 000 r/min離心10 min，取上清液置于-80℃冰箱備用。取每桶取血后的3尾對蝦剝離肝胰腺并稱重、記錄數(shù)據(jù)，然后取其平均值，作為該桶對蝦的肝體比;剩余部分取肌肉，保存于-20℃冰箱;另取一部分對蝦的腸道進(jìn)行掃描電鏡觀察。

飼料、全蝦及肌肉樣品中的水分含量采用105℃常壓干燥法測定，粗蛋白質(zhì)含量采用微量凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，粗灰分含量采用550℃馬弗爐灼燒法測定;血清生化指標(biāo)在OLYMPU-SAU600型全自動生化分析儀(日本)上測定。

1.4 計算公式

增重率(WGR，%)=100×(終末體重-初始體重)/初始體重;

特定生長率(SGR，%/d)=100×(ln終末均重-ln初始均重)/試驗天數(shù);

成活率(SR，%)=100×試驗結(jié)束時蝦尾數(shù)/試驗開始時蝦尾數(shù);

蛋白質(zhì)效率(PER)=(終末體重-初始體重)/(攝食量×飼料粗蛋白質(zhì)含量);

飼料效率(FE)=(終末蝦總重+死蝦總重-初始蝦總重)/(投飼總量×飼料干物質(zhì)含量);肝體比(HSI，%)=100×肝胰腺重/體重。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并結(jié)合 Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦生長性能的影響

由表3可知，同一魚粉含量下，添加植物精油的組的WGR、SGR和PER均顯著高于未添加植物精油的組(P＜0.05)，但上述4組均顯著低于對照組(P＜0.05);同一魚粉含量下，添加植物精油的組的FE均高于未添加植物精油的組(P＞0.05)，且與對照組無顯著差異(P＞0.05)，未添加植物精油的組均顯著低于對照組(P＜0.05);各組凡納濱對蝦的 SR和HSI無顯著差異(P＞0.05)，且SR均在96%以上。

表3 飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦生長性能的影響Table 3 Effects of dietary plant essential oil on growth performance of Litopenaeus vannamei

2.2 飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦全蝦和肌肉成分的影響

由表4可知，各組凡納濱對蝦全蝦和肌肉營養(yǎng)成分均無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，各組凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)均無顯差異(P＞0.05)。

2.4 飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦腸道絨毛的影響

由圖1可以看出，當(dāng)飼料中魚粉含量降低時，添加植物精油能夠改善凡納濱對蝦腸道絨毛脫落的狀況。

表4 飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦全蝦及肌肉營養(yǎng)成分的影響Table 4 Effects of dietary plant essential oil on whole body and muscle nutritional components of Litopenaeus vannamei %

表5 飼料中添加植物精油對凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of dietary plant essential oil on serum biochemical indiexes of Litopenaeus vannamei

3 討論

3.1 飼料中植物精油對凡納濱對蝦生長性能及腸道健康的影響

植物精油因其特有的性質(zhì)而被廣泛利用，目前已知的大約有3 000種，其中300種在制藥、農(nóng)業(yè)、食品、化妝品、香水、廁所清潔行業(yè)具有重要的商業(yè)用途［13］，許多研究者正試圖發(fā)現(xiàn)植物精油的功能與其組分之間的關(guān)聯(lián)，以便加以利用［24-26］。近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)精油對動物的消化系統(tǒng)具有促進(jìn)作用［27-28］，但沒有試驗證明植物精油能夠提高凡納濱對蝦的生長性能。本研究發(fā)現(xiàn)，降低飼料中魚粉含量后，未添加植物精油的組凡納濱對蝦的生長性能變差，添加植物精油的組凡納濱對蝦的生長性能得到提高，其FE甚至達(dá)到對照組水平。本研究中，隨著飼料中魚粉含量的降低，豆粕和花生粕的含量均上升，劉立鶴等［29］研究發(fā)現(xiàn)飼料中花生粕的含量在20%以下時對凡納濱對蝦的生長性能沒有顯著影響，而另有研究表明豆粕中較高的抗?fàn)I養(yǎng)因子不僅會降低水產(chǎn)動物的增重率和飼料利用率［30-33］，還會引起腸道菌落結(jié)構(gòu)的改變［34-35］。本試驗中每種飼料中花生粕的含量均低于20%，這可能暗示著飼料中過多的豆粕會引起腸炎，從而導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)病理性變化。

Brunet等［36］認(rèn)為甲殼動物的消化道根據(jù)重要性可以分為前腸、中腸、后腸3個部分，其中前腸和尾腸的內(nèi)表層被殼丁質(zhì)覆蓋，在消化過程中不起重要作用，并且腸道微絨毛與腸道結(jié)構(gòu)之間關(guān)系復(fù)雜，對營養(yǎng)吸收也具有重要作用［37］。本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中添加植物精油，凡納濱對蝦腸道絨毛脫落狀況得到改善，且同一魚粉含量下，添加植物精油的組凡納濱對蝦的生長性能要優(yōu)于未添加植物精油的組。植物精油之所以能夠改善腸道絨毛脫落狀況，可能是因為其能夠有效抑制凡納濱對蝦腸道有害細(xì)菌生長，調(diào)節(jié)菌落的平衡，提高營養(yǎng)吸收效率。研究表明，植物精油對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌等均具有一定殺菌活性［38-41］。Yeh 等［22］發(fā)現(xiàn)，牛樟提取物能夠有效抑制病原菌，并增強(qiáng)凡納濱對蝦自身免疫力和抗病力。Giannenas等［21］發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼料中添加香芹酚或麝香草酚能夠提高虹鱒的飼料利用效率，并減少其腸道內(nèi)的厭氧細(xì)菌的數(shù)量。目前植物精油的抗菌機(jī)制仍未確定，主要有3種解釋:一是作為典型的親脂性物質(zhì)，能夠穿過細(xì)菌細(xì)胞壁及細(xì)胞膜并損壞其結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引起細(xì)菌內(nèi)部大分子的泄露，致使細(xì)菌溶解;二是影響脂質(zhì)層穩(wěn)定，溶解胞體中的脂肪體;三是影響能量代謝及還原酶系［42-46，26］。

圖1 各組凡納濱對蝦的中腸超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡，8 900倍)Fig.1 Ultrastructure of midgut of Litopenaeus vannamei in groups(TEM，8 900 times)

3.2 飼料中植物精油對凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)的影響

動物處于正常生理狀態(tài)下，機(jī)體能夠維持各項生理指標(biāo)的動態(tài)穩(wěn)定，而血液組成的變化在一定程度上能夠反映出動物此時的健康狀態(tài)［47］，其中膽固醇和甘油三酯是血脂的重要組成部分，且都主要在肝臟中合成，因此血清膽固醇和甘油三酯含量的變化在一定程度上能夠反映肝臟的某些生理功能是否正常。血糖是動物重要的能量來源，并且可以作為物理脅迫因子的指標(biāo)［48］。本研究發(fā)現(xiàn)，各組凡納濱對蝦的血清膽固醇、甘油三酯、葡萄糖和總蛋白含量均無顯著差異，表明飼料中添加植物精油不會破壞凡納濱對蝦的正常生理狀態(tài)。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性是反映肝臟損傷程度的指標(biāo)，是機(jī)體代謝必不可少的酶類，在平衡機(jī)體氨基酸“池”以及蛋白質(zhì)、脂肪與糖之間物質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮非常重要的作用［49］，血清中ALT和AST活性的高低在一定程度上可以反映肝細(xì)胞損傷的程度［50］;堿性磷酸酶(AKP)是一種膜結(jié)合蛋白，與甲殼動物海水中磷質(zhì)與鈣質(zhì)的吸取、磷酸鈣的生成、甲殼素的形成和分泌直接相關(guān)，并且能夠與其他水解酶類構(gòu)成解毒體系，在甲殼動物非特異免疫中發(fā)揮著重要作用［51］，并且還可以通過測定血淋巴中的AKP活性的高低來判斷對蝦非特異免疫機(jī)能的強(qiáng)弱［52］;乳酸脫氫酶(LDH)廣泛存在于動物機(jī)體組織中，當(dāng)組織細(xì)胞壞死時，該酶在血清中增加，是水生動物重要的同工酶之一［53］。本研究發(fā)現(xiàn)，各組凡納濱對蝦的血清AST、ALT、AKP和LDH活性均無顯著差異，表明飼料中添加植物精油不會對凡納濱對蝦的非特異性免疫及正常生理狀態(tài)造成不良影響。

4 結(jié)論

在降低魚粉含量的情況下，飼料中添加0.02%的植物精油能夠改善凡納濱對蝦生長性能及腸道健康。

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