腸道菌群對仔雞腸道發(fā)育、黏膜形態(tài)和免疫器官發(fā)育的影響

吳娟娟 賴水明 潘 珂 涂小麗 朱年華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，南昌 330045)

動物腸道內(nèi)棲息著大量的微生物稱為腸道菌群(intestinal flora)，它們在促進宿主食物消化、營養(yǎng)吸收、刺激免疫系統(tǒng)發(fā)育和抵御外來病菌侵入等方面起著重要作用［1］。仔雞孵出后48～60 h，乳酸菌在嗉囊、十二指腸急增形成菌群優(yōu)勢，4日齡，仔雞盲腸中乳酸菌占被檢測到細菌總數(shù)的25%［2］，7 日齡，乳酸菌在整個小腸形成優(yōu)勢［3］。有關(guān)動物腸道菌群功能的研究大多集中在小鼠上，并以無菌動物為模型［4］。國內(nèi)外使用無菌雞作為“悉生(gnotobiotic)動物”模型已進行了不少研究。Salter等［5］用無菌雞為模型研究了正常雞和無菌雞對蛋白質(zhì)消化和尿酸排泄的差異。Drew等［6］研究了蛋氨酸和羥基蛋氨酸的消化能力的差異。大量研究證實無菌雞已是一種有潛力用于菌群代謝試驗的動物模型。大量研究證實，選擇雞作為無菌動物模型，不僅因為其飼養(yǎng)過程簡單，進化史及成長背景優(yōu)良，還因為其在孵化之前我們就能判斷其父母代是否達無菌狀態(tài)［7］。為探討腸道菌群與宿主之間的潛在關(guān)系，本實驗室通過無菌隔離器放置千級實驗室內(nèi)進行仔雞飼養(yǎng)21 d后，對雞排泄物通過 GB/T 14926.41—2001方法進行檢測后，并未發(fā)現(xiàn)檢測菌，說明“無菌雞”模型建立成功，為本次試驗提供條件。本試驗采用3臺隔離器，通過添加單一雞源性乳酸菌或混合菌(盲腸內(nèi)容物)，旨在研究其對仔雞腸道發(fā)育、黏膜結(jié)構(gòu)與免疫器官發(fā)育的影響，揭示腸道菌群與宿主的關(guān)系，為調(diào)控腸道菌群提供理論基礎(chǔ)，同時為腸道微生物的功能研究摸索出一種新的研究方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用無特定病原體(SPF)種蛋購置于北京梅里亞維通實驗動物有限公司，經(jīng)消毒后放無菌實驗室的孵化器中孵化。

無菌飼糧:按NRC(2004)雞營養(yǎng)需要配制，其飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，配制好后采用鈷－60輻射源照射，并經(jīng)檢測無菌。

乳酸菌發(fā)酵液:為雞源性乳酸菌，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)點提供，經(jīng)中國科學(xué)院微生物所經(jīng)鑒定為嗜酸乳桿菌(L.acidophilus);配料前用MRS液體培養(yǎng)基發(fā)酵后備用。

盲腸內(nèi)容物:無菌取21日齡普通肉雞盲腸內(nèi)容物用滅菌生理鹽水稀釋后入無菌飼糧中。

1.2 試驗動物與飼糧

1.2.1 肉雞悉生動物模型的建立

選用來自SPF雞場即將孵化SPF種蛋60枚，先進行無菌化處理后放入無菌隔離器內(nèi)充入無菌空氣，而后置孵化器內(nèi)進行孵化，孵化出生后放入無菌隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。飼糧經(jīng)鈷－60照射滅菌做成無菌飼糧，自來水經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌21 min做成無菌飲用水;飼糧、水分別由滅菌筒經(jīng)隔離器的傳遞倉對接送入;空氣由高壓滅菌后再過濾介質(zhì)傳入隔離器內(nèi)［8］。無菌仔雞飼養(yǎng)3周后，隔離器內(nèi)仔雞存活8只以上，同時通過檢查腸道(糞便)內(nèi)無細菌存在，即悉生動物模型建立成功。

1.2.2 試驗動物分組及飼養(yǎng)

本次試驗根據(jù)飼喂飼糧的不同分為3個組:飼喂無菌飼糧作為對照組(CT組);飼喂無菌飼糧和嗜酸乳桿菌(配制的飼糧中活菌數(shù)大于1×106CFU/g)作為乳酸菌組(LB組);飼喂無菌飼糧和雞盲腸內(nèi)容物(盲腸內(nèi)容物添加量0.1%)作為盲腸內(nèi)容物組(CC組)。本次試驗選用來自SPF雞場的愛拔益加(AA)雞種蛋60枚，無菌化處理后入塑料隔離器并放入無菌孵化器內(nèi)進行孵化，孵化出生后，隨機分3組分別放入無菌隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，基礎(chǔ)飼糧為玉米－豆粕型飼糧。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tabe 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)重點實驗室無菌實驗室進行。所有雞只在無菌隔離器內(nèi)(無菌隔離器經(jīng)檢測潔凈度可達100級)飼養(yǎng)。在試驗開始前1周無菌室及隔離器用甲醛和高錳酸鉀進行徹底熏蒸消毒，舍內(nèi)溫度、濕度和光照按常規(guī)飼養(yǎng)管理要求控制。整個飼喂期間自由采食和飲水，飼喂期為21 d。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 各腸段生長發(fā)育

于仔雞出生后7、14日齡從各組取4只雞屠宰，試驗結(jié)束時(21日齡)從每個組隨機取6羽試驗雞進行屠宰，小心分離出十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸，并用軟尺準確量取各段長度，同時計算各腸段的長度系數(shù)(即該腸段長度占整個腸道長度百分比)。

1.4.2 屠宰指標及免疫器官指數(shù)

于飼喂結(jié)束后從每個組隨機取6羽試驗雞先進行空腹稱活重然后屠宰，去毛、頭、腳稱取胴體重，開膛后將頭、腳、心臟、肝臟去掉后稱取全凈膛重，剝離胸肌肉、肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊稱重。根據(jù)以上結(jié)果計算屠宰率，全凈膛率，胸肌率及肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊指數(shù)。

1.4.3 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)

取十二指腸、空腸、回腸段，用10%甲醛固定液固定，常規(guī)蘇木精－伊紅(HE)染色后制成5μm石蠟切片，觀察絨毛形態(tài)，計算絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)處理采用Excel 2003，試驗結(jié)果分析采用SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序進行方差分析，用Duncan氏法多重比較，結(jié)果以平均值±標準誤(SE)表示。以P＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 不同菌群對仔雞腸道發(fā)育的影響

由表2可知，與CT組相比，飼喂乳酸菌可顯著降低7日齡的盲腸長度系數(shù)(P＜0.05)，飼喂盲腸內(nèi)容物可顯著降低7、14、21日齡的盲腸長度系數(shù)(P＜0.05);飼喂乳酸菌和盲腸內(nèi)容物可一定程度提高各階段空腸長度系數(shù)，其中在7日齡呈顯著性提高(P＜0.05);飼喂盲腸內(nèi)容物僅在7日齡時呈顯著降低十二指腸長度系數(shù)(P＜0.05);飼喂乳酸菌和盲腸內(nèi)容物僅在7日齡呈顯著提高回腸長度系數(shù)(P＜0.05)。直腸長度系數(shù)在各組間差異均不顯著(P＞0.05)。

表2 腸道菌群對各腸段生長發(fā)育的影響Table 2 Effects of intestinal flora on the growth and development of intestine of chicks %

續(xù)表2

不同日齡各組仔雞盲腸大小見圖1，從中可看出，無菌雞盲腸發(fā)達，腸道菌群可抑制盲腸發(fā)育。并且盲腸內(nèi)容物也存在明顯變化，飼喂乳酸菌和盲腸內(nèi)容物的仔雞盲腸細長且富有彈性，剪開腸道可發(fā)現(xiàn)內(nèi)容物黏稠，CT組的盲腸肥大且壁薄，剪開腸道可發(fā)現(xiàn)內(nèi)容物稀且充滿氣泡。

圖1 各階段仔雞盲腸解剖圖Fig.1 The various stages of chicken cecal dissections

2.2 不同腸道菌群對仔雞屠宰指標的影響

由表3可知，與CT組相比，飼喂乳酸菌和盲腸內(nèi)容物對仔雞21日齡的雞胴體重、屠宰率和胸肌率均無顯著差異(P＞0.05);LB組的全凈膛率卻顯著高于CC組(P＜0.05)。

表3 不同腸道菌群對21日齡仔雞屠宰指標的影響Table 3 Effects of different intestinal flora on 21-day-old chicks slaughter Indexes

2.3 不同腸道菌群對仔雞免疫器官指數(shù)的影響

不同腸道菌群對仔雞免疫器官指數(shù)的影響見表4，從中可看出，與CT組相比，腸道菌群顯著提高仔雞的脾臟指數(shù)(P=0.010)，由CT組的0.13%提高到0.16% ～0.17%;對仔雞肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)雖略有提高，但差異不顯著(P＞0.05)。

表4 不同腸道菌群對仔雞免疫器官指數(shù)的影響Table 4 Effects of different micro flora on immune organ indexes of chicks %

2.4 不同腸道菌群對仔雞小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

不同處理對仔雞十二指腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)見表5，由表中可看出，與CT組相比，飼喂乳酸菌和盲腸內(nèi)容物仔雞的十二指腸絨毛高度增加，但差異不顯著(P＞0.05)，飼喂盲腸內(nèi)容物仔雞的十二指腸隱窩深度顯著降低(P＜0.05)。對回腸的相關(guān)黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生顯著的影響(P＞0.05)。2個試驗組的仔雞十二指腸的V/C分別高出CT組39.67%和45.84%(P＜0.05);2個試驗組空腸 V/C分別高出 CT 組21.6%和19.7%(P=0.010);LB 組的回腸V/C與CT組相比無顯著差異(P＞0.05)，而CC組僅高出CT組13.75%(P＞0.05)。由此可以得出，飼喂乳酸菌和盲腸內(nèi)容物后，小腸段V/C的相對差異主要體現(xiàn)在十二指腸和空腸部位。

表5 不同腸道菌群對仔雞小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 5 Effects of different microflora on mucosal morphology structure in the intestine of chicks

不同處理對仔雞十二指腸黏膜形態(tài)顯微照見圖2，可以看出，LB組和CC組的十二指腸絨毛比CT組絨毛更細、更長且清晰有光澤;LB組十二指腸絨毛比CC組絨毛要稍長、稍稀疏一些。

圖2 十二指腸黏膜形態(tài)顯微照片F(xiàn)ig.2 The microphoto of small intestinal mucosa morphology(10×)

3 討論

3.1 “無菌動物”模型建立的意義

無菌動物是指飼養(yǎng)在無菌屏障系統(tǒng)(無菌隔離器)中，用現(xiàn)有方法不能檢出任何微生物(包括酵母和真菌)及寄生蟲的動物［9］。無菌動物的產(chǎn)生和發(fā)展已有近百年歷史，自Cohendy于1908年首次成功進行了無菌雞的飼養(yǎng)，1944年Luckey和Lakey進行了無菌雞飼糧營養(yǎng)的研究;1948年美國Lobund小組成功飼養(yǎng)的無菌雞，并產(chǎn)卵和孵化出新一代雛雞;1937年Balzam使用無菌雞對B族維生素缺乏癥及雞體內(nèi)能否合成，對B族維生素發(fā)現(xiàn)起了重大作用，同時也推動了無菌動物培養(yǎng)的發(fā)展［4］。Drew 等［6］利用無菌雞研究了蛋氨酸和羥基蛋氨酸的消化能力的差異。利用無菌動物研究腸道微生物對宿主健康與營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用的關(guān)系，抗生素作用機理與替代有重要的理論和實踐意義。

3.2 腸道菌群對仔雞腸道發(fā)育的影響

物腸道的生長發(fā)育直接影響動物生長和健康狀況，腸道微生物菌群的建立顯示了腸道菌群可能參與宿主腸道的發(fā)育［10］。腸道菌群對雞消化器官影響已有不少報道，陳佳等［11］研究發(fā)現(xiàn)用乳酸菌培養(yǎng)物飼喂肉雞后，21日齡時，試驗組小腸長度小于對照組。雷燕［12］研究發(fā)現(xiàn)益生菌能降低肉雞腸道長度，可改善腸道形態(tài)。

利用無菌動物研究腸道微生物對動物腸道發(fā)育的影響最為客觀和明顯。Reyniers等［13］研究發(fā)現(xiàn)無菌雞小腸重量要顯著低于常規(guī)雞，主要原因是其黏膜固有層變薄。Gordon等［14］研究發(fā)現(xiàn)無菌雞的小腸發(fā)育程度不如常規(guī)雞歸結(jié)于其黏膜表面積減少。Abrams等［15］研究證實與常規(guī)小鼠相比，無菌鼠的小腸重量、長度均顯著降低。Bartizal等［16］的研究發(fā)現(xiàn)無菌沙鼠的盲腸較發(fā)達于飼喂腸道菌群后的沙鼠。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂乳酸菌和盲腸內(nèi)容物可一定程度提高7日齡十二指腸長度，顯著提高空腸、回腸長度，結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。

無菌動物的盲腸比普通動物大得多，在鼠、兔和雞都一致，這也被認為是無菌動物的標志［17］。Wostmann等［18］報道的無菌鼠盲腸比普通常規(guī)動物要大5～6倍，無菌雞盲腸達體重的6% ～10%;其后發(fā)現(xiàn)無菌動物盲腸體積增大可能與盲腸內(nèi)容物的氧化還原電位密切相關(guān)，盲腸內(nèi)存在較多的堿性反應(yīng)，其 pH 升高 1.0［19］。Phillips 等［20］進一步證明，無菌豚鼠的盲腸之所以肥大是因為其內(nèi)容物中含有較多的陽性的氧化還原電位。而無菌雞盲腸肥大具體原因還有待更深一步的研究。

3.3 腸道菌群對仔雞免疫器官指數(shù)的影響

機體免疫器官指數(shù)是衡量機體免疫功能的初步指標，免疫器官的發(fā)育狀況直接反映出機體的免疫應(yīng)答水平［21］。家禽免疫器官(法氏囊、脾臟、胸腺等)的重量是評價營養(yǎng)素對家禽免疫力影響的重要指標。脾臟作為重要的淋巴器官，也是機體最大的外周免疫器官，是產(chǎn)生致敏淋巴細胞和抗體的場所之一，同時具有造血、濾血、清除衰老細胞和微生物等功能。腸道菌群與宿主長期處于共生狀態(tài)，主要參與生物拮抗(防御感染)、營養(yǎng)吸收與代謝、免疫系統(tǒng)發(fā)育等［22］。曹海寧等［23］研究表明正常腸道菌群在促進免疫系統(tǒng)發(fā)育，維持正常免疫功能，協(xié)同拮抗病原菌入侵方面發(fā)揮著重要作用。李志川等［24］研究表明腸道菌群不僅對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育和激活有重要作用，同樣對腸道外全身免疫系統(tǒng)也有重要作用。

無菌動物由于沒有腸道微生物的刺激，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育緩慢，脾臟縮小，無三級濾泡，網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞功能降低，Coates［25］研究指出無菌雞的腎臟、脾臟、甲狀腺明顯小于常規(guī)雞。而本試驗僅發(fā)現(xiàn)無菌雞脾臟較小，而對肝臟、胸腺、法氏囊指數(shù)沒有產(chǎn)生顯著的影響。Gordon等［26］發(fā)現(xiàn)無菌雞心臟小、血量變少，血紅細胞計數(shù)和血細胞壓積增大。另有相關(guān)報道指出無菌雞血管和肌肉對腎上腺素的敏感性顯著降低［27］。脾臟具有造血、濾血、清除衰老細胞和微生物等功能，我們不難推測出上述結(jié)果均有可能與脾臟相關(guān)。從本試驗發(fā)現(xiàn)，添加腸道菌群脾臟指數(shù)顯著提高，說明腸道菌群可刺激免疫系統(tǒng)發(fā)育，促進脾臟的生長，在一定程度上加強機體免疫力。

3.4 腸道菌群對仔雞小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

小腸作為仔雞營養(yǎng)成分吸收的主要場所，在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收過程中發(fā)揮著重要作用。小腸絨毛作為腸黏膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其高度的變化直接影響小腸消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力。Caspary［28］報道指出絨毛高度的增加會促使小腸接觸營養(yǎng)物質(zhì)的面積增大，從而增強小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隱窩是腸上皮細胞分化的部位，其深度反映了隱窩細胞的增殖率和成熟度，隱窩變淺分泌功能增強，反之亦然。V/C綜合反映小腸的功能狀況，其下降表明小腸消化、吸收功能下降［29］。Awad 等［30］發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加益生菌與合生元可顯著增加35日齡肉雞空腸、回腸的絨毛高度和V/C，體重也有顯著提升。Rask等［31］研究發(fā)現(xiàn)，單一定植菌的悉生小鼠或無菌小鼠與普通小鼠比較，后者能通過上調(diào)小腸黏膜上皮主要組織相容性復(fù)合體的表達，進而促進小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整。

早先Reyniers等［13］發(fā)現(xiàn)無菌動物小腸重量變輕，其原因是小腸黏膜組織較薄，絨毛表面積顯著減少;Abrams等［15］也發(fā)現(xiàn)無菌動物腸道黏膜細胞具有較低的代謝更新率。Guent等［32］報道普通鼠的十二指腸和回腸表皮細胞有絲分裂指數(shù)較無菌鼠高，這可能是因腸道菌群所致，雖然其機理尚不明確［33］。本次研究結(jié)果與前人結(jié)果基本一致，說明腸道菌群刺激腸道組織形態(tài)和腸道黏膜發(fā)育。

4 結(jié)論

①腸道菌群能促進仔雞前期(7日齡)的空腸和回腸的發(fā)育;無菌雞盲腸發(fā)育較快，其腸道長度系數(shù)要顯著高于有菌雞。

②腸道菌群提高仔雞十二指腸和空腸的絨毛高度，降低隱窩深度，影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收。

③腸道菌群促進仔雞脾臟的發(fā)育，提高機體免疫力。

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