高效液相色譜法測(cè)定玉米中的游離酚和結(jié)合酚

李 艷 劉梅森 萬(wàn)紅霞 孫海燕 從彥麗 許柏球 劉 冬

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院1，廣州 510640）（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市發(fā)酵精制檢測(cè)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，深圳 518055）（深圳市味奇生物科技有限公司3，深圳 518109）

高效液相色譜法測(cè)定玉米中的游離酚和結(jié)合酚

李 艷1，2劉梅森3萬(wàn)紅霞2孫海燕2從彥麗2許柏球2劉 冬2

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院1，廣州 510640）
（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院深圳市發(fā)酵精制檢測(cè)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，深圳 518055）
（深圳市味奇生物科技有限公司3，深圳 518109）

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定玉米中游離酚和結(jié)合酚的檢測(cè)方法，包括原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素、槲皮素。有機(jī)溶劑提取玉米中的游離酚，堿法提取玉米中的結(jié)合酚，以ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）為分析柱，乙腈（A）和含0.4%乙酸的超純水（B）為流動(dòng)相梯度洗脫，采用二極管陣列檢測(cè)器280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。14種酚類化合物在一定濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 9，加標(biāo)回收率為90%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%～3.59%。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能用來(lái)同時(shí)測(cè)定玉米中的游離酚和結(jié)合酚。

玉米 游離酚 結(jié)合酚 高效液相色譜

玉米是世界上分布最廣泛的糧食作物之一，和小麥、水稻并列為世界三大糧食作物。因富含酚類化合物，玉米有預(yù)防心臟病、高血壓、癌癥等功效。多酚化合物是廣泛存在于自然界的一類含有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物［1－2］，主要包括類黃酮、酚酸等物質(zhì)［3］，具有抗氧化等能力［4－5］，能降低心血管疾病、癌癥的發(fā)病率，延緩衰老［6－9］。目前對(duì)于玉米的研究［10－13］主要集中于采用有機(jī)溶劑提取色素、黃酮等酚類化合物，再進(jìn)行純化、結(jié)構(gòu)鑒定和活性評(píng)價(jià)。然而，玉米等谷物中的酚類化合物通過(guò)氫鍵、疏水相互作用或共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)、糖類等結(jié)合，根據(jù)其結(jié)合程度由疏至密依次可分為游離型和結(jié)合型［14］。Sosulski等［15］建立了谷物可溶性游離多酚和不溶性結(jié)合多酚的分離提取方法。Liu［1］等用該方法比較了部分水果、蔬菜和谷物的多酚化合物含量結(jié)果表明，玉米中的酚類主要以結(jié)合形式存在，約占總酚的85%。采用有機(jī)溶劑提取大大低估了玉米的酚類含量及其生物活性，目前對(duì)于結(jié)合酚的組成研究甚少。為了準(zhǔn)確評(píng)估玉米的酚類含量，有必要對(duì)玉米中游離酚和結(jié)合酚分別進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)對(duì)玉米中的游離酚和結(jié)合酚進(jìn)行提取，建立了高效液相色譜法測(cè)定玉米中的游離酚和結(jié)合酚，并對(duì)建立的測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SHIMADZU 20A高效液相色譜系統(tǒng)（DGU－20A3在線脫氣器、LC－20AT泵、SIL－20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO－20A柱溫箱、SPD－M20A檢測(cè)器）：日本SHIMADZU；超純水機(jī)：美國(guó)Millipore；高速勻漿機(jī)：德國(guó)IKA；高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendof；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)Heidolph。

乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素、槲皮素：美國(guó)Sigma公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫 30℃；流速1.0 mL／min；進(jìn)樣量 20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為 280 nm；流動(dòng)相為乙腈（A）和含0.4%乙酸的超純水（B），梯度洗脫，0～5 min，3%A；5～10 min，3%～7%A；10～25 min，7%～10%A；25～30 min，10%～12%A；30～45 min，12%～15%A；45～50 min，15%A；50～70 min，15%～30%A；70～75 min，30%～3%A；75～80 min，3%A。

1.3 樣品前處理

1.3.1 游離酚提取

稱取2.0 g絕干樣品粉末于100 mL燒杯中，加入50 mL正己烷，冰浴10 000 r／min勻漿 10 min，3 000 g離心5 min。去除上清液。沉淀加入50 mL 80% 冰丙酮，冰浴10 000 r／min勻漿10 min。3 000 g離心5 min，取上清液。用80% 冰丙酮重復(fù)提取2次，合并上清液45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干。用80%甲醇溶液重溶，定容至10 mL，過(guò)0.45μm膜，待測(cè)。

1.3.2 結(jié)合酚提取

往沉淀里加入20 mL 2 mol／L NaOH，混勻，充滿N2室溫旋轉(zhuǎn)振蕩消化1 h。加4 mL濃HCl，混勻，放置2 min。再加入20 mL乙酸乙酯，搖勻，萃取5 min，3 000 r／min離心5 min，取上清液。下層液體再用乙酸乙酯萃取5次，合并上清液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，用80% 甲醇溶液重溶，定容至10 mL，過(guò)0.45μm膜，待測(cè)。

2 結(jié)果和討論

2.1 色譜條件的選擇

酚類化合物含有酚羥基，流動(dòng)相中加入適當(dāng)比例的酸可以抑制酚羥基的電離，達(dá)到改善分離效果和修飾峰形的作用。本試驗(yàn)考察了乙酸比例（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）對(duì)酚類化合物的分離效果及峰形的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙酸比例為0.10%～0.30%時(shí)，其分離度不佳，當(dāng)乙酸比例增至0.40%時(shí)，其分離度及峰形均有明顯改善。故試驗(yàn)最終選擇0.4%乙酸水溶液作為最佳流動(dòng)相。

2.2 線性范圍、檢出限及定量限

在最佳的色譜條件下，測(cè)定不同濃度的酚類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，液相色譜圖見(jiàn)圖1，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)作圖，得到相應(yīng)的回歸方程（見(jiàn)表1）。結(jié)果顯示14種酚類化合物分別在 1.33～42.80、12.56～402.00、1.33～42.40、1.93～61.60、1.29～41.20、0.76～24.40、1.46～46.80、4.75～152.00、0.53～16.88、0.88～28.00、8.00～128.00、3.86～123.60、2.70～43.20和3.20～51.60μg／mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999 4和0.999 9之間。以3倍信噪比（S／N）測(cè)定14種酚類物質(zhì)的檢出限（LOD），以10倍S／N計(jì)算定量下限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

表1 14種酚類化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.3 精密度和穩(wěn)定性

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，按照1.2色譜條件進(jìn)行分析。重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素峰面積的 RSD分別為 1.16%、1.12%、1.28%、1.70%、1.35%、1.52%、1.35%、1.31%、1.35%、1.57%、0.87%、1.34%、0.78%和0.79%，結(jié)果表明該方法的精密度良好。

準(zhǔn)確吸取玉米酚溶液20μL，于0、12和24 h分別進(jìn)樣，測(cè)得原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.13%、0.67%、1.19%、0.21%、1.10%、0.51%、0.93%、0.51%、1.80%、1.66%、0.30%、0.93%、1.60%和2.39%，結(jié)果表明在24 h內(nèi)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.4 回收率

精密吸取已知含量的同一樣品溶液9份，分成3組，每組以低、中、高3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行分析。原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素的回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。14種酚類成分的加標(biāo)回收率為90%～108%，說(shuō)明該方法具有良好的通用性。

表2 14種酚類化合物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 再現(xiàn)性試驗(yàn)

以黑玉米為研究對(duì)象，按1.3方法制備游離酚及結(jié)合酚，平行試驗(yàn)3次，用1.2色譜法進(jìn)行分析，測(cè)得游離酚中原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素和槲皮素峰面積的RSD分別為 0.04%、0.19%、0.01%、1.51%、0.17%、0.22%、0.17%、0.81%、0.30%、0.72%、0.89%、5.55%、0.95%和0.10%，結(jié)果表明該方法的再現(xiàn)性良好。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取白玉米、黃玉米和黑玉米為研究對(duì)象，按1.3方法制備游離酚及結(jié)合酚樣品，用1.2色譜法進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

測(cè)定結(jié)果可知，以結(jié)合形式存在的阿魏酸是玉米中含量最高的酚類化合物，這與文獻(xiàn)［5］報(bào)道的阿魏酸是玉米中最主要的酚酸組分相符，與“以結(jié)合形式存在的阿魏酸占總阿魏酸的93%以上”也相符。

表3 樣品含量的測(cè)定結(jié)果／μg／mL

3 結(jié)論

HPLC法可用于定性定量分析玉米中的游離酚和結(jié)合酚，包括原兒茶酸、龍膽酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、橙皮素、槲皮素。該法不僅具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，還有低檢出限定量限、高精密度、好穩(wěn)定性及高回收率的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)玉米中游離酚和結(jié)合酚的測(cè)定可知，玉米中的酚類主要以結(jié)合酚形式存在，結(jié)合酚中主要為阿魏酸，可能以阿魏酸酯等形式存在于玉米中，下一步可采用HPLC－MS法確定玉米中酚類成分的結(jié)構(gòu)。

［1］Liu R H.Whole grain phytochemicals and health［J］.Journal of Cereal Science，2007，46（3）：207－219

［2］Dykes L，Rooney L W.Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits［J］.Cereal Food World，2007，52（3）：105－111

［3］Okarter N，Liu R H.Health Benefits of Whole Grain Phytochemicals［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2010，50（3）：193－208

［4］Fardet A，Rock E，Remesy C.Is the in vitro antioxidant potential of whole－grain cereals and cereal products well reflected in vivo［J］.Journal of Cereal Science，2008，48（2）：258－276

［5］Adom K K，Liu R H.Antioxidant Activity of Grains［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（21）：6182－6187

［6］Rajeshkumar N V，Joy K L，Kuttan Girija，et al.Antitumour and anticarcinogenic activity of Phyllanthusamarus extract［J］.Journal of Ethnopharmacology，2002，81（1）：17－22

［7］Luo W，Zhao M M，Yang B，et al.Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified fromPhyllanthus emblicaL.fruit［J］.Food Chemistry，2011，126（1）：277－282

［8］O'Sullivan A M，O'Callaghan Y C，O'Grady M N，et al.In vitro and cellular antioxidant activities of seaweed extracts prepared from five brown seaweeds harvested in spring from the west coast of Ireland［J］.Food Chemistry，2011，126（3）：1064－1070

［9］Chan J M，Wang F，Holly E A.Whole Grains and Risk of Pancreatic Cancer in a Large Population－based Case－Control Study in the San Francisco Bay Area，California［J］.A-merican Journal of Epidemiology，2007，166（10）：1174－1185

［10］朱洪梅.玉米黃色素提取工藝及其抗氧化活性研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2010，25（7）：15－20

［11］Perry A，Rasmussen H，Johnson E J.Xanthophyll（lutein，zeaxanthin）content in fruits，vegetables and corn and egg products［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2009，22（1）：9－15

［12］Buranov A U，Mazza G.Extraction and purification of ferulic acid from flax shives，wheat and corn bran by alkaline hydrolysis and pressurised solvents［J］.Food Chemistry，2009，115（4）：1542－1548

［13］肖春玲，張少穎，孫英.紫玉米色素的抗氧化活性研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（2）：18－22

［14］PEREZ－JIMENEZ J，Torres J L.Analysis of Nonextractable Phenolic Compounds in Foods：The Current State of the Art［J］.Food Chemistry，2011，59（24）：12713－12724

［15］Sosulski F，Krygier K，Hogge L.Free，Esterified，and Insoluble－Bound Phenolic Acids.1.Extraction and Purification Procedure［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1982，30（2）：337－340.

Determination of Soluble Phenolics and Bound Phenolics in Corn by High Performance Liquid Chromatography

Li Yan1，2Liu Meisen3Wan Hongxia2Sun Haiyan2Cong Yanli2Xu Baiqiu2Liu Dong2

（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology1，Guangzhou 510640）（Shenzhen Key Laboratory of Fermentation，Purification and Analysis，Shenzhen polytechnic2，Shenzhen 518055）（Shenzhen Weicky Biotech Co.，Ltd3，Shenzhen 518109）

An effective high performance liquid chromatographic（HPLC）method had been developed for the determination of soluble phenolics and bound phenolics，including protocatechuic acid.2.5－Dihydroxybenzoic acid，4－Hydroxybenzoic acid，chlorogenic acid，vanillic acid，caffeic acid，syringic acid，Epicatechin.coumalic acid，ferulic acid，sinapic acid，rutin，hesperetin and quercetin.Soluble phenolics were extracted with organic solvent；bound phenolics were extracted by alkaline.The separation and quantification of soluble phenolics and bound phenolics were achieved on ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）with mobile phase of acetonitrile（A）and 0.4%acetic acid（B）with diode array detector（DAD）at 280 nm.The results indicated that the calibration curves of fourteen phenolics had expressed a satisfied linear relationships between peak areas and concentrations，with their correlation coefficients of 0.999 4～0.999 9，The average recoveries of fourteen phenolics were in the range of 90%～108%with relative standard deviations of 0.03%～3.59%，The method shall be suitable for determination of soluble phenolics and bound phenolics in corn.

corn，soluble phenols，bound phenols，high performance liquid chromatography（HPLC）

TS207.3

A

1003－0174（2015）09－0108－04

廣東省國(guó)際合作項(xiàng)目（2012B050600031），省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目 （2012B091100411），深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年創(chuàng)新項(xiàng)目（601422K27012）

2014－03－31

李艷，女，1982年出生，博士，活性成分功效研究

劉冬，男，1968年出生，教授，食品生物技術(shù)