微生物源化合物合成基因簇異源表達研究進展

黃 穎 趙 晨 關 雄 張曉琳

（國家糧食局科學研究院1，北京 100037）（福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室2，福州 350002）

微生物源化合物合成基因簇異源表達研究進展

黃 穎1，2趙 晨1關 雄2張曉琳1

（國家糧食局科學研究院1，北京 100037）
（福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室2，福州 350002）

微生物次級代謝產(chǎn)物具有多種多樣的生物活性，在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和食品領域有著廣闊的應用前景。異源表達策略與不斷發(fā)展的DNA克隆和改造技術相結合，成為一種有效的研究手段，能夠用于提高天然活性化合物的產(chǎn)量，獲得新結構類似物，闡明沉默基因簇的功能，還能夠通過表達宏基因組DNA來獲得新活性物質(zhì)。本文對異源表達次級代謝基因簇的研究策略和成功案例進行綜述，側重于聚酮類物質(zhì)和非核糖體肽的異源表達。

異源表達 次級代謝基因簇 聚酮類物質(zhì) 非核糖體肽

微生物的次級代謝產(chǎn)物多種多樣，其中有許多天然產(chǎn)物具有無可比擬的生物學活性，在醫(yī)療領域和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有極大的應用價值。聚酮類化合物是由聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）催化低級羧酸縮合而成，是次級代謝產(chǎn)物中最大的種類，臨床上所使用的多種藥物都屬于這一類化合物，在農(nóng)業(yè)上使用的一些農(nóng)藥、獸藥等也屬于這類化合物［1］。一些對人類極為安全并能有效殺滅靶標生物的聚酮類化合物也被應用于食品領域［2－3］。由非核糖體肽合酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）合成的肽類化合物同樣具有廣泛的生物活性［4］。許多重要次級代謝產(chǎn)物的合成是由PKS和NRPS兩類合成酶所催化的，被稱為雜合 NRPS／PKSs［5］合成途徑。這些微生物次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)和利用對于人類社會意義巨大，但原始產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)量通常比較低，或有應用上的問題，比如基因操作困難、生長緩慢、不易培養(yǎng)，甚至是無法培養(yǎng)時，使得化合物的分離、生產(chǎn)和修飾改造受到限制。研究表明，天然產(chǎn)物的合成、調(diào)控和抗性基因都是成簇排列在微生物的基因組內(nèi)，因此在合適的宿主內(nèi)異源表達天然和人工的生物合成基因簇就成為獲得大量天然產(chǎn)物及其衍生物的捷徑［6］。異源表達還能夠激活“沉默”的生物合成基因簇，從而達到獲得新活性化合物的目的［7］。

本研究對目前異源表達天然產(chǎn)物生物合成基因簇的策略進行綜述，側重于聚酮合酶（PKSs）、非核糖體肽酶（NRPSs）和雜合 NRPS／PKSs合成途徑。同時，為了對異源表達策略的實際應用有所幫助，對生物合成基因簇的克隆、操作和在異源宿主中的遺傳方式，以及異源宿主的選擇及改造進行了深入的討論（如圖1），并對如何利用異源表達開發(fā)新化合物進行綜述。

1 生物合成基因簇的克隆策略

近年來，發(fā)展出了一些將小片段DNA組裝成基因、生物合成基因簇乃至整個基因組的方法，例如Golden Gate組裝方法［8］、不依賴于基因序列和連接反應的基因克隆方法（Sequence and Ligation Independent Cloning）［9］、Gibson等溫一步法［10］等。DNA合成和組裝策略的優(yōu)勢在于能夠實現(xiàn)基因簇的密碼子優(yōu)化和調(diào)控基因的選擇，并可以添加或刪除酶切位點［11］。在一個簡單的宿主中（例如大腸桿菌（Escherichiacoli）或黃色粘細菌 （Myxococcusxanthus））中表達人工設計并合成組裝的生物合成基因簇將成為新型化合物的來源之一［12］。

圖1 異源表達生物合成基因簇的常規(guī)流程圖

PKS和NRPS基因簇一般在10～120 kb之間。通過構建基因文庫的手段來克隆基因簇時，一般會使用黏粒（cosmid）或福斯質(zhì)粒（fosmid）來克隆30～35 kb的 DNA大片段，或者用細菌人工染色體（BAC）或P1派生人工染色體（PAC）來獲得100kb以上的插入片段［13－14］。一個基因簇很有可能被分別克隆在幾個載體上。利用Red／ET同源重組技術，能夠在大腸桿菌中快速的完成縫合的過程［15］。而完整的RecE和RecT所介導的線性DNA之間的同源重組被稱為 LLHR（linear plus linear homologous recombination），可用于直接克隆基因簇，而無需構建基因組文庫［16］。首先，將基因組DNA進行酶切，以釋放含有目的基因簇的DNA片段；然后構建一個線性質(zhì)粒，使其兩端與目的基因簇末端同源；最后在大腸桿菌內(nèi)進行LLHR同源重組，從而將目的基因簇直接克隆到載體上。利用這樣的方法，已從基因組中成功克隆了一系列 PKS／NRPS基因簇［17］。TAR（transformation－associated recombination）技術則利用了釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中天然的高效重組能力，可以從已測序的基因組中直接克隆大片段的基因簇，但對于基因簇的進一步操作并不便捷［18］。Brady小組構建了一個S．cerevisiae／E．coli／Streptomyces穿梭BAC質(zhì)粒pTARa，從柯氏檸檬酸桿菌（Citrobacterkoseri）的基因組DNA中直接克隆了56 kb的大腸桿菌毒素 colibactin基因簇［19］。LLHR和TAR方法將加速對“沉默”基因簇和環(huán)境宏基因組的潛力挖掘，從而推動新活性化合物的開發(fā)和利用［20］。

2 生物合成基因簇在異源宿主中的遺傳策略

生物合成基因簇在宿主中的遺傳方式分為兩種，一種是在質(zhì)粒上進行復制和表達，另一種則是直接整合到宿主的染色體上。通過質(zhì)粒表達基因簇時，在前體供應充足的情況下，增加生物合成基因簇的拷貝數(shù)能夠促進異源表達產(chǎn)物的合成［21］。將基因簇整合在宿主染色體上會增加基因簇的遺傳穩(wěn)定性，方法包括同源重組、轉座和噬菌體介導的重組系統(tǒng)。同源重組是定點插入，可直接失活宿主次級代謝途徑［22］。轉座的整合效率比同源重組要高，60 kb的埃博霉素（epothilone）基因簇是目前通過轉座技術插入宿主染色體的最大基因簇［23］。噬菌體所介導的重組系統(tǒng)則被廣泛應用于以鏈霉菌為宿主的異源表達研究中，最近也被用于在M．xanthus中表達人工合成的 epothilone基因簇［24］。

3 異源宿主

3.1 表達PKSs途徑的異源表達宿主

天藍色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor）自身產(chǎn)生幾種聚酮類化合物，是最早用于表達聚酮類化合物的宿主。S．coelicolor有許多可以運用的載體和啟動子系統(tǒng)，例如actI、mel、aphI、ermE、tipA、PnitA、gylP1／P2等［25－27］。6－脫氧紅霉內(nèi)酯 B（6－dEB）、榴菌素（granaticin）、美達霉素（medermycin）等都在天藍色鏈霉菌中得以成功表達［28－29］。變鉛青鏈霉菌（S．lividans）和S．coelicolor一樣是表達聚酮類化合物的常用宿主，S．coelicolor的遺傳改造方法和工具也同樣適用于S．lividans［30］。

E．coli表達聚酮類化合物有很多優(yōu)勢，例如生長周期短（增倍時間20 min）、遺傳操作簡便等。但其與放線菌在生理、代謝、調(diào)控等方面差異較大，其自身的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶PPTase對底物有較強的選擇性，無法對異源的ACP進行翻譯后修飾，并且在大腸桿菌中大分子酶系的折疊存在困難。此外，E．coli中可能缺乏一些前體物質(zhì)。經(jīng)過一系列遺傳改造，E．coliBAP1成功表達了 6dEB［31］。

來源于真核生物的聚酮類化合物可能更適合于在Sacharomycescerevisiae、黑曲霉（Aspergillusniger）、米曲霉（Aspergillusoryzae）和構巢曲霉（Aspergillus nidulans）等真核宿主中表達，以簡化需要刪除內(nèi)含子等問題。曲霉屬能夠產(chǎn)生許多天然次級代謝產(chǎn)物，一旦克隆了聚酮類化合物的基因簇就可以通過原生質(zhì)體融合和電轉化將其轉入曲霉中進行表達，可使用的啟動子系統(tǒng)包括amyB、trpC、alcA等等［32］。目前已在曲霉屬中成功地異源表達了黑色素（melanin）、角鯊抑素（squalestatin）、莫納可林（monacolin J）等多種化合物［33－34］。

3.2 表達NRPS和雜合NRPS／PKSs合成途徑的異源表達宿主

鏈霉菌和E．coli都可作為非核糖體肽類的異源表達宿主。目前在鏈霉菌中已成功表達了epothilone、達托霉素（daptomycin）、卷曲霉素（capreomycin）和噻可拉林（thiocoraline）。E．coli自身能夠產(chǎn)生一種非核糖體肽（鐵螯合載體腸菌素（siderophore enterobactin））［35］，其作為異源宿主表達 NRPS的能力可能高于PKSs，目前已經(jīng)成功表達一系列NRPS和雜合NRPS／PKSs合成途徑，如耶爾森菌素（yersiniabactin）、棘霉素（echinomycin）和 epothilone等［36－37］。

枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）擁有生長迅速（繁殖增倍時間1h）、轉化容易、背景清晰的優(yōu)勢和天然的非核糖體肽合成能力［38］，但目前缺少自我復制的質(zhì)粒，仍有許多整合性質(zhì)?？晒┦褂茫?9］。Bacillus subtilis中異源表達地衣芽孢桿菌（B．licheniformis）的桿菌肽bacitracin基因簇時，bacitracin的產(chǎn)量較原始菌株提高了50%。49kb的基因簇是分2次整合到染色體中［40］，每次插入的片段比較小，這可能與大片段的插入效率較低有關，但有報道認為100kb大片段的插入是可能的［41］。

惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）也是NRPS合成途徑的常用異源宿主，盡管是革蘭氏陰性菌，卻具備了產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物的能力以及與放線菌和粘細菌相近的GC含量，并且生長迅速、研究透徹，有許多可以運用的遺傳工具，已被用于異源表達黏液噻唑（myxothiazol）、環(huán)肽化合物（myxochromide S）等［42］。

3.3 敲除宿主的主要次級代謝途徑

不同次級代謝途徑之間是相互競爭的，敲除宿主菌的主要次級代謝基因簇，能夠減少對異源表達合成途徑的競爭作用。阿維鏈霉菌（S．a(chǎn)vermitilis）基因組左端粒區(qū)域含有許多次級代謝途徑基因簇，將該區(qū)域逐步敲除，構建不產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的異源表達通用菌株［43］，將20個次級代謝基因簇導入到所構建的通用宿主S．a(chǎn)vermitilisSUKA17或 22中，大部分得以成功表達，少數(shù)不能夠表達的異源基因簇也在更換了基因簇啟動子或者調(diào)控基因的啟動子之后獲得了異源表達產(chǎn)物［44］。對S．coelicolorM145的4個主要次級代謝基因簇進行敲除，也能提高該菌株異源表達的能力［45］。生二素鏈霉菌（S．a(chǎn)mbofaciens）BES2074菌株的主要次級代謝產(chǎn)物是螺旋霉素（spiramycin），阻斷其合成途徑后，異源表達脂肽類抗生素A54145，未經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化，產(chǎn)量便達到了385 mg／L，是原始產(chǎn)生菌產(chǎn)量的 285%［46］。

4 新化合物的開發(fā)

大多數(shù)化合物的生物合成途徑在現(xiàn)有的培養(yǎng)條件下是不表達的，或者表達量很低，被稱為“沉默”的生物合成基因簇［12］，是新型化合物的寶庫。誘導沉默基因簇表達的方法主要包括培養(yǎng)條件的優(yōu)化和調(diào)控基因的改造［12］，以及進行異源表達。在纖維堆囊菌SorangiumcellulosumSo ce56的基因組中發(fā)現(xiàn)一個沉默的Ⅲ型PKS［47］，將這個PKS在Pseudomonasputida中進行異源表達，證實了該PKS的產(chǎn)物是淡黃霉素flaviolin。

環(huán)境中存在大量不可培養(yǎng)的微生物，能夠培養(yǎng)的微生物所占的比例不足1%［48］，利用宏基因組文庫技術能夠深入挖掘微生物天然產(chǎn)物。通常的做法是構建宏基因組DNA的cosmid、fosmid或者BAC文庫，并在E．coli、S．lividans或P．putida等通用菌株中進行異源表達［49－50］。近來，Brady等［51］采用基于PCR的篩選策略，在環(huán)境DNA cosmid文庫中分離出38 kb的BE－54017基因簇，在白色鏈霉菌S．a(chǎn)lbus中成功地表達了這一抗癌物質(zhì)。

異源表達天然和人工改造過的生物合成基因簇都會產(chǎn)生新的衍生物［52］。將來自藍藻Mooreaproducens的新型脂肽barbamide生物合成基因簇在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌S．venezuelae中進行表達，產(chǎn)生了新的衍生物4－O－demethylbarbamide［53］。將新生霉素 novobiocin生物合成基因簇中的甲基轉移酶基因novO失活后在S．coelicolor中異源表達，產(chǎn)生了C8位未被甲基取代的novobiocin類似物，再表達鹵化酶基因clohal，產(chǎn)生了2個C8位被氯原子取代的novclobiocin類似物［54］。將金鏈菌素aureothin生物合成基因簇中參與起始單位（對硝基苯甲酰CoA）合成的基因aurG失活后在S．lividans中異源表達，并不能產(chǎn)生aureothin，加入非天然底物對氰基苯甲酸后，產(chǎn)生了一種aureothin的類似物——aureonitrile，具有更強的生物活性［55］。

5 結論與展望

微生物源活性天然產(chǎn)物在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和工業(yè)領域具有極大的商業(yè)價值。天然產(chǎn)生菌的產(chǎn)量通常無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，在原始菌株生長緩慢、不易培養(yǎng)、基因操作困難的情況下，異源表達其合成基因簇無疑是一條捷徑。

靶標生物耐藥性的增強迫使我們必須尋找新的活性化合物。對可培養(yǎng)微生物次級代謝產(chǎn)物的篩選已經(jīng)難以發(fā)現(xiàn)新型的天然產(chǎn)物，因而微生物基因組中種類繁多的生物合成基因簇引起了極大的關注。利用異源表達的手段來激活“沉默”基因簇，或挖掘宏基因組，將成為發(fā)現(xiàn)新活性化合物的一大途徑。此外，在異源宿主中改造已知的天然基因簇也是獲得新化合物的重要途徑，還將有助于闡明天然產(chǎn)物生物合成途徑的分子機理，從而推動今后組合生物學的發(fā)展。

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［55］Ziehl M，He J，Dahse H M，et al.Mutasynthesis of aureonitrile：an aureothin derivative with significantly improved cytostatic effect［J］.Angewandte Chemie International Edition，2005，44（8）：1202－1205.

Recent Developments Towards the Heterologous Expression of Microbial Compound Biosynthetic Gene Clusters

Huang Ying1，2Zhao Chen1Guan Xiong2Zhang Xiaolin1

（Academy of State Administration of Grain1，Beijing 100037）
（Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology，Ministry of Education，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University2，F(xiàn)uzhou 350002）

Microbial secondary metabolites have varieties of biological activities，which have broad application prospect in the fields of pharmaceutical，agrochemical and food.Heterologous expression coupled with developing DNA clone and transformation technology has become an efficient pathway that enables the optimization of natural active compounds yields，production of new structural analogues，functional elucidation of silent gene clusters and generation of new active compounds through expressing metagenomic DNA.In this review，remarkable success stories as well as the experimental approaches will be presented with the emphasis on heterologous expression of polyketide and non－ribosomally biosynthesized peptide compounds.

heterologous expression，secondary metabolite gene cluster，polyketide，nonribosomal peptide

Q936

A

1003－0174（2015）09－0133－07

國家自然科學基金 （31300092），糧食公益性行業(yè)科研專項（201313002－3）

2014－03－10

黃穎，女，1989年出生，碩士，抗生素發(fā)酵和基因工程研究

張曉琳，女，1975年出生，研究員，微生物發(fā)酵和基因工程研究