紅景天苷抑制高糖損傷神經(jīng)元活性caspase 3和促進(jìn)BDNF表達(dá)

楊志華 宋 憶 楚廣品 邱 平 彭文鵬 孟憲芳*

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，武漢 430030;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院西區(qū)心內(nèi)科，武漢 430030)

葡萄糖的新陳代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的一系列病變，血糖在體內(nèi)外的神經(jīng)功能方面有重要作用，血糖代謝的紊亂和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)［1］。研究表明，糖尿病能引起認(rèn)知功能障礙［2］。與非糖尿病人相比，糖尿病患者患有認(rèn)知功能障礙有更大的概率更大的風(fēng)險(xiǎn)［3］。紅景天苷(Salidroside，Sal)是紅景天的一個(gè)酚類糖苷，紅景天生長(zhǎng)在高山上，在中國(guó)很久以前就一直用來(lái)抗疲勞。有研究表明，Sal具有神經(jīng)保護(hù)的作用，并且可以改善糖尿病腦病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力［4-5］。然而，Sal神經(jīng)保護(hù)的作機(jī)制尚未完全闡明。本文擬探討Sal對(duì)高糖刺激體外培養(yǎng)神經(jīng)元的影響，以及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為治療糖尿病腦病提供一定的理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料

Cleaved caspase-3和BDNF抗體購(gòu)自于Cell signaling Technology;NeuN購(gòu)自于Millipore公司;驢抗鼠熒光二抗購(gòu)自武漢艾美捷生物技術(shù)有限公司;胰酶和多聚賴氨酸(MW大于300000)購(gòu)于Sigma公司。BDNF ELASA試劑盒購(gòu)自于達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。紅景天苷購(gòu)自于上海同田生物技術(shù)有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)基和B27均購(gòu)自于Gibco公司。

2.方法

2.1 神經(jīng)元原代培養(yǎng)

參考原代神經(jīng)元培養(yǎng)的方法［6］，所有步驟均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。健康SD孕鼠，孕期17到19天，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。頸椎脫臼處死孕鼠，剖腹取出胎鼠，斷頭置于D-Hanks溶液中，分離皮質(zhì)，去除腦膜，剪碎組織，用0.125%的胰酶37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5分鐘，用10%的胎牛血清終止消化，并吹打至無(wú)大的組織碎塊，200目篩網(wǎng)過(guò)濾并回收濾液到離心管中，800r/min離心5min，用DMEM高糖培養(yǎng)基將沉淀吹打重懸，細(xì)胞分別種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔2×106個(gè)細(xì)胞。24孔板中每孔5×105個(gè)細(xì)胞(培養(yǎng)皿事先用多聚賴氨酸處理過(guò))，4小時(shí)后用Neurobasal培養(yǎng)基全換液，之后每隔三天半量換液。

2.2 神經(jīng)元鑒定

體外原代培養(yǎng)6～8天的皮質(zhì)神經(jīng)元，從孔板內(nèi)取出蓋玻片用PBS沖洗(5 min×3次)，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗，0.2%TritonX-100破膜20 min，PBS沖洗，5%BSA室溫封閉30 min后，加入鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶50)于濕盒內(nèi)，4℃冰箱過(guò)夜，次日將標(biāo)本置于37℃復(fù)溫l h，然后以PBS沖洗3次，加入驢抗鼠FITC熒光二抗(1∶300)進(jìn)行標(biāo)記。Hochest復(fù)染核后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。陰性對(duì)照除一抗以PBS替代NeuN外，其余步驟相同。NeuN定位于細(xì)胞核內(nèi)，核中出現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性結(jié)果，陰性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)不出現(xiàn)綠色熒光。高倍鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)視野內(nèi)全部細(xì)胞及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其均值。神經(jīng)元細(xì)胞純度%=(NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/Hochest陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))×100%。

2.3 細(xì)胞處理

皮質(zhì)神經(jīng)元生長(zhǎng)6天時(shí)，細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組，高糖組，Sal組(Sal終濃度分別為50和100μM)，Sal組在加入藥物1h后，高糖組和Sal組分別加入高糖，使高糖終濃度為50mM。37℃繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，24h后收細(xì)胞的上清、蛋白和爬片。

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞cleaved caspase-3和BDNF的蛋白表達(dá)

Western blot的詳細(xì)方法如文獻(xiàn)所述［6］，用PBS清洗三遍細(xì)胞，最后一次將PBS吸棄干凈，加入RIPA 裂解液，12000r/min，4℃離心 15min，上清液即為總蛋白。每孔加入等量的蛋白樣品，用十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠恒壓電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，與1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜，用TBST漂洗后，室溫孵育二抗(1:2000稀釋)1h，漂洗后用ECL液發(fā)光，X線膠片顯影，最后用Image J軟件分析結(jié)果。

2.5 ELISA試劑盒檢測(cè)上清中BDNF的含量

取培養(yǎng)細(xì)胞上清，4℃，1000r/min，離心 5min，取離心后的上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)BDNF的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤標(biāo)示，應(yīng)用SPSS13.0軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，行單因素方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)及鑒定

神經(jīng)元在培養(yǎng)第6天分化成熟，可見細(xì)胞散在生長(zhǎng)，胞體小，折光性強(qiáng)，形成密集的神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)第6天，運(yùn)用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN抗體利用免疫熒光方法標(biāo)記神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比的為90.12±1.25%，見圖1。

圖1 大鼠皮層神經(jīng)元鑒定Fig.1 The identification of cortical neurons of rat

2.Sal對(duì)高糖處理神經(jīng)元cleaved caspase 3表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量為17 kDa處有一清晰的cleaved caspase 3蛋白條帶，以43 kDa β-actin為內(nèi)參采用灰度值半定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，50 mM高糖刺激體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元，可顯著誘導(dǎo)cleaved caspase 3表達(dá)，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而50和100μM Sal處理組，可顯著降低高糖誘導(dǎo)的cleaved caspase 3的表達(dá)，與高糖處理組相比，差異顯著(P＜0.05)(圖2)。

圖2 Sal對(duì)高糖處理神經(jīng)元中cleaved caspase 3表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Sal on the expression of cleaved caspase 3 in high glucose-treated neuronsCtrl:control;Vehl:Vehicle;Sal:Salidroside;*P＜0.05vs Ctrl;#P＜0.05 vs vehl

3.Sal對(duì)高糖處理神經(jīng)元中BDNF表達(dá)的影響

圖3 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖處理組神經(jīng)元中BDNF的表達(dá)未見明顯變化，50μM Sal亦未導(dǎo)致BDNF表達(dá)的改變。但100μM Sal可以顯著增加神經(jīng)元中BDNF的表達(dá)。

圖3 Sal對(duì)高糖處理神經(jīng)元中BDNF表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Sal on the expression of BDNF in high glucose-treated neurons.Ctrl:control;Vehl:Vehicle;Sal:Salidroside;*P ＜ 0.05 vs Ctrl

4.Sal對(duì)神經(jīng)元培養(yǎng)液中BDNF含量的影響

與對(duì)照組相比，高糖處理組神經(jīng)元培養(yǎng)液中BDNF的含量明顯降低(P＜0.05)。與高糖處理組相比，50μM Sal組培養(yǎng)液中的BDNF含量呈增高趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性;但100μM Sal組中培養(yǎng)液中BDNF的含量明顯增加，差異顯著(P＜0.05)(圖4)。

圖4 Sal對(duì)神經(jīng)元培養(yǎng)液中BDNF含量的影響Fig.4 Effects of Sal on the content of BDNF in cultured medium.Ctrl:control;Vehl:Vehicle;Sal:Salidroside;*P＜0.05 vs Ctrl;#P＜0.05 vs Vehl

討 論

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)患糖尿病人數(shù)達(dá)1億人，其多種急慢性并發(fā)癥是患者致死和致殘的重要原因。糖尿病不僅影響周圍神經(jīng)［7］，其亦可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響多種蛋白的表達(dá)，使大腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及神經(jīng)精神等方面發(fā)生病理改變，導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)和記憶能力的降低。輕者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重者出現(xiàn)癡呆，影響老年患者的生活質(zhì)量［8］。這種由糖尿病引起的認(rèn)知障礙和大腦的神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)改變，稱為糖尿病腦病。

盡管自1965年Nielsen就提出“糖尿病腦病”的概念［9］，但目前糖尿病腦病病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究表明，神經(jīng)細(xì)胞的變性、凋亡導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目減少是癡呆及其它中樞神經(jīng)退行性疾病發(fā)生認(rèn)知功能障礙的重要病理基礎(chǔ)［10］。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是參與糖尿病腦病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)是一類由神經(jīng)元、神經(jīng)所支配的組織和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，且為神經(jīng)元生長(zhǎng)與存活所必需的蛋白質(zhì)分子，具有支持神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育和功能完整性的作用，包含神經(jīng)生長(zhǎng)因子、BDNF和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素等。其中BDNF及其受體主要是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，其中海馬和皮質(zhì)的含量最高。BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)和維持神經(jīng)元正常的生理功能起關(guān)鍵作用。敲低BDNF的表達(dá)，小鼠的學(xué)習(xí)能力及記憶能力大大降低，從而說(shuō)明了 BDNF可能參與了空間學(xué)習(xí)及記憶過(guò)程。另有證據(jù)表明，BDNF在糖尿病模型大鼠海馬中的表達(dá)下降，提示BDNF可能參與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中50 mM的高糖刺激并未導(dǎo)致BDNF表達(dá)的下降，但導(dǎo)致培養(yǎng)液中BDNF含量的下降。這提示，高糖導(dǎo)致BDNF分泌減少，進(jìn)而導(dǎo)致BDNF與其trkB受體結(jié)合減少，致使其不能發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

因此，尋找有效的藥物，抑制高糖所致的神經(jīng)元損傷顯得尤為必要。Sal是紅景天的主要活性成分，其在抗衰老、調(diào)節(jié)新陳代謝、雙向調(diào)節(jié)血糖、抗疲勞、提高中樞興奮性、抗輻射等方面有顯著療效［12］。有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)Sal對(duì)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)功能及記憶功能的改善作用，但其作用機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，Sal可以顯著抑制高糖所致的細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白cleaved caspase 3的表達(dá)，同時(shí)紅景天苷可以誘導(dǎo)BDNF的表達(dá)及其在培養(yǎng)液中的含量。這提示紅景天苷可以通過(guò)增強(qiáng)BDNF的信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮其神經(jīng)元的保護(hù)作用。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以通過(guò)抑制活性caspase 3和促進(jìn)BDNF表達(dá)和分泌，進(jìn)而抑制高糖所致的神經(jīng)元損傷。該研究為臨床治療糖尿病腦病提供一定的理論基礎(chǔ)。

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