一株多粘類芽胞桿菌防治油茶炭疽病初探

胡飛，胡本進，李昌春，周子燕，徐麗娜，李瑞雪

(1．安徽省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽 合肥 230031;2．安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽 合肥 230031)

油茶Camellia oleifera Abel．是我國南方重要的經(jīng)濟林樹種，在長江流域、西南地區(qū)、華南各地有廣泛栽培。油茶炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz．，發(fā)病具有鮮明的季節(jié)性，果實、葉片均可侵染發(fā)病，在湖南、安徽等油茶主要分布區(qū)發(fā)生普遍，引起嚴重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，造成油茶籽實減產(chǎn)10%～30%，重病區(qū)減產(chǎn)40%～50%［1-4］。目前國內(nèi)主要采用化學藥劑防治油茶炭疽病，百菌清、波爾多液、退菌特、甲基硫菌靈、葉斑凈(30%苯甲·丙環(huán)唑)［5-7］等效果較好。但是化學農(nóng)藥長期使用導致大量農(nóng)藥殘留，誘發(fā)抗藥性，降低茶油質(zhì)量，同時也污染了生態(tài)環(huán)境，因此發(fā)展高效穩(wěn)定的生物農(nóng)藥是油茶行業(yè)的趨勢和方向。利用拮抗微生物防治油茶炭疽病的報道較多，趙秀云［8］等分離的解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生抗菌脂肽對油茶炭疽病具有較好的控制作用;周國英［9-11］等發(fā)現(xiàn)拮抗鏈霉菌F10能影響油茶炭疽病菌菌絲正常生長和分生孢子的萌發(fā)，內(nèi)生枯草芽胞桿菌Y13能誘導油茶相關抗性酶活性的提高，同時對油茶炭疽病也具有較好的防治效果。多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa具有植病防治和促生作用，美國環(huán)境保護署(EPA)已將其列為可商業(yè)應用的微生物，常用于防治植物青枯病、枯萎病、黃萎病等，國內(nèi)利用多粘類芽胞桿菌開發(fā)出的生物農(nóng)藥康地雷得對植物枯萎病有較好防效［12-13］。近2 a發(fā)現(xiàn)多粘類芽胞桿菌對水稻稻瘟?。?4］、小麥根腐病［15］、煙草黑脛病［16］、紅辣椒疫病［17］等都具有抑制作用，但防治油茶炭疽病研究尚未見報道。作者以多粘類芽胞桿菌DN-1為試驗藥劑，測定對油茶炭疽病菌的孢子萌發(fā)的影響及其抑菌率，通過林間防治試驗探索多粘類芽胞桿菌防治油茶炭疽病的可行性和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 多粘類芽胞桿菌DN-1，于青島海域海泥中分離(Genebank登錄號:KM891591)，由安徽省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所保存。

油茶炭疽病病原菌菌株YTJ-1，YTJ-2，YTJ-7，YTJ-14，由安徽皖南地區(qū)油茶林病葉中分離并鑒定，經(jīng)轉(zhuǎn)接、純化培養(yǎng)后供試。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA［18］培養(yǎng)基用于病原菌培養(yǎng)、保存和對峙試驗;LB［19］培養(yǎng)基用于DN-1菌株活化;不加瓊脂的PD培養(yǎng)液用于病原菌孢子懸液及DN-1菌株種子液制備;液體發(fā)酵培養(yǎng)基［20］用于DN-1菌株液體發(fā)酵。

1.2 油茶炭疽病菌孢子懸浮液制備將4株油茶炭疽病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，30℃下培養(yǎng)7 d，加入無菌水從平板上洗脫孢子，以4層滅菌紗布過濾制成孢子懸浮液，稀釋成相同濃度備用。

1.3多粘類芽胞桿菌DN-1不同芽胞濃度發(fā)酵液制備將經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后的DN-1接入液體種子培養(yǎng)基(PD)中，培養(yǎng)24 h獲得種子液，然后按接種量5%轉(zhuǎn)至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h后獲得發(fā)酵母菌液。取適量發(fā)酵菌液用無菌蒸餾水配置成不同濃度:10，20，40，80，160億芽胞/L。于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多粘類芽胞桿菌DN-1對4株油茶炭疽病菌株孢子萌發(fā)的影響試驗采用凹玻片法。取無菌凹玻片，先加入1%葡萄糖無菌液、再加入4株油茶炭疽病菌的孢子懸浮液20μL，最后加入不同芽胞濃度的多粘類芽胞桿菌DN-1的發(fā)酵液20μL或百菌清(2 g/L)、30%苯甲·丙環(huán)唑(0．12 g/L)藥液，蓋上蓋玻片，放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中于28℃下培養(yǎng)24 h，檢查孢子萌發(fā)情況(當孢子芽管長度大于孢子的短半徑時即視為萌發(fā))，每個濃度重復4次，記錄孢子萌發(fā)情況，計算抑制率。

1.5 多粘類芽胞桿菌DN-1對4株油茶炭疽病菌株抑菌率測定采用紙碟法［21］測試不同芽胞濃度DN-1的抑菌活性。在PDA培養(yǎng)基的平板中央放置1塊油茶炭疽病菌餅(直徑0．3 cm)，其周圍均勻放置4個濕潤的紙碟(直徑0．3 cm)，5個芽胞濃度及百菌清、30%苯甲·丙環(huán)唑藥液各取50μL涂抹其上，28℃下培養(yǎng)。每個處理重復4次，以不放置紙碟的處理作對照。待對照的菌落將長滿平板時，用卡尺測量菌落直徑(cm)。每個菌落用十字交叉法垂直測量直徑各1次，取其平均值，以油茶炭疽病病原菌的生長速度計算抑菌率。

1.6 林間防治試驗試驗地設在舒城縣湯池鎮(zhèn)、舒茶鎮(zhèn)兩地油茶園區(qū)。5年生以上茶樹，樹高2～4 m，行間距2．0～2．5 m。在油茶炭疽病發(fā)病初期和高峰期各噴藥2次。試驗設5個芽胞濃度(終濃度，667 m2用水量50 L)，設百菌清(2 g/L)、30%苯甲·丙環(huán)唑(0．12 g/L)、清水3個對照(清水)，每個處理為10株，4次重復，共8個處理，樹冠噴施藥液。試驗期間無噴施其它防治油茶炭疽病類藥劑，無異常天氣出現(xiàn)。油茶炭疽病發(fā)病初期防治試驗于2014年4月15日、25日各施藥1次，此時油茶炭疽病開始出現(xiàn);發(fā)病高峰期防治試驗于7月5日、15日各施藥1次。兩次試驗于第2次施藥后30 d檢查葉片油茶炭疽病的病情等級和防治效果［22］。

1.7 數(shù)據(jù)處理用Spass19．0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并比較各處理的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽胞桿菌DN-1發(fā)酵液對孢子萌發(fā)的影響不同芽胞濃度多粘類芽胞桿菌DN-1發(fā)酵液對4株油茶炭疽病菌孢子萌發(fā)都有抑制作用。其對孢子萌發(fā)抑菌率與芽胞濃度呈正相關(見表1)，其中當濃度為(10～160)億芽胞/L時對4株油茶炭疽病菌菌株的孢子萌發(fā)抑菌率41．50%～88．75%，高低濃度處理間差異極顯著。當DN-1發(fā)酵液濃度為160億芽胞/L，孢子抑制率87%以上;與百菌清處理差異不顯著，低于30%苯甲·丙環(huán)唑處理。

表1 多粘類芽胞桿菌DN-1對4株油茶炭疽病菌的孢子萌發(fā)抑制率 %

2.2 多粘類芽胞桿菌DN-1發(fā)酵液抑菌率測定

抑菌率試驗再次表明多粘類芽胞桿菌DN-1對4株油茶炭疽病菌生長有明顯抑制作用(見表2)。10億芽胞/L對4株油茶炭疽病菌抑菌率35．81%～47．78%，隨著處理濃度的增加，抑菌率隨之增強，160億芽胞/L的抑菌率75．10%～77．56%，5個濃度處理間抑菌率差異顯著;DN-1發(fā)酵液160億芽胞/L抑菌率與百菌清處理相當，差異不顯著;而顯著低于30%苯甲·丙環(huán)唑處理。

表2 多粘類芽胞桿菌DN-1對油茶炭疽病菌的抑菌作用

2.3 林間防治2014年4—7月在湯池鎮(zhèn)、舒茶鎮(zhèn)兩地油茶園區(qū)進行的林間防治試驗表明，多粘類芽胞桿菌DN-1對油茶炭疽病都具有較好的林間防效(表3，4)，當濃度高于80億芽胞/L時，兩地不同施藥時期的林間防效較穩(wěn)定。

在湯池鎮(zhèn)，DN-1濃度為(10～160)億芽胞/L時，發(fā)病初期施藥后30 d調(diào)查的防效29．80%～68．91%，160億芽胞/L時防效與對照藥劑百菌清無明顯差異，但低于對照藥劑30%苯甲·丙環(huán)唑，差異不明顯;發(fā)病高峰期施藥后30 d調(diào)查的防效26．61%～50．20%，160億芽胞/L濃度與30%苯甲·丙環(huán)唑處理間防效差異極顯著。在油茶炭疽病發(fā)病高峰期施藥的林間防效顯著低于發(fā)病初期施藥。

在舒茶鎮(zhèn)，DN-1濃度為(10～160)億芽胞/L時，發(fā)病初期施藥后30 d調(diào)查的防效31．11%～67．55%，160億芽胞/L濃度林間防效低于30%苯甲·丙環(huán)唑處理，差異不顯著;發(fā)病高峰期施藥后30 d調(diào)查的防效21．95%～52．66%，160億芽胞/L濃度處理低于30%苯甲·丙環(huán)唑的防效，差異顯著。在油茶炭疽病發(fā)病高峰期施藥的林間防效也顯著低于發(fā)病初期施藥。

表3 多粘類芽胞桿菌DN-1對油茶炭疽病菌的林間藥后30 d防治效果(湯池鎮(zhèn))

表4 多粘類芽胞桿菌DN-1對油茶炭疽病菌的林間藥后30 d防治效果(舒茶鎮(zhèn))

3 討論

室內(nèi)和林間防治試驗研究結(jié)果表明多粘類芽胞桿菌DN-1對油茶炭疽病能起到較好的防治作用，與報道的枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌一樣均可用于油茶炭疽病林間防治。當終濃度達160億芽胞/L時，DN-1對4株油茶炭疽病菌孢子抑制率87%以上，室內(nèi)抑菌率75%以上;在油茶炭疽病發(fā)病初期施藥林間防效70%左右，而在發(fā)病高峰期施藥僅有50%左右。這說明多粘類芽胞桿菌DN-1具有林間防治油茶炭疽病的應用價值，這不僅拓展了多粘類芽胞桿菌的抑菌譜，也為在油茶綠色防控方面提供了新的菌種資源。

DN-1各濃度處理抑菌率均低于孢子抑制率，這可能與多粘類芽胞桿菌芽胞及發(fā)酵液直接與分生孢子作用有關，能較強的抑制分生孢子萌發(fā)。當多粘類芽胞桿菌孢子濃度達160億孢子/L時，在油茶炭疽病發(fā)病初期施藥可以起到較好的控制作用，與百菌清防效接近，而在發(fā)病高峰期施藥防效明顯下降，兩地林間防治效果穩(wěn)定。這可能是在油茶炭疽病發(fā)病初期即病情指數(shù)較低時，有利于多粘類芽胞桿菌DN-1競爭占位，快速誘導油茶自身抗病系統(tǒng)啟動，從而抵擋病原菌的進一步侵入，也可能是發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)能在發(fā)病初期較好的抑制病原菌擴展。本次林間試驗證明多粘類芽胞桿菌防治油茶炭疽病，應在發(fā)病初期施藥，這與生物農(nóng)藥預防為先的施用方式相符合。

多粘類芽胞桿菌作用機制多樣，既有抗菌多肽、蛋白等起作用，也可通過菌體與病原菌在生態(tài)位競爭生存空間和營養(yǎng)物質(zhì)，還可以與植物相互作用引起植物體內(nèi)一系列生理生化變化，進而使植物對病害產(chǎn)生抗性［23］。本研究雖然證明了多粘類芽胞桿菌DN-1對油茶炭疽病的生防作用，但對具體起作用的是活菌體還是發(fā)酵液中的具體活性物質(zhì)未做分析，對防治機理也未涉及，以后需要對其在油茶葉片上的定殖動態(tài)［24］、發(fā)酵液中活性物質(zhì)分析［25］、以及與油茶抗病性相關酶活的生理指標測定做進一步完善，進而為研制新型油茶炭疽病生物防治藥劑奠定基礎。

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