固定化金屬親和層析富集麥胚蛋白金屬螯合肽的研究

王曉萍 郭曉娜 朱科學(xué) 彭 偉 周惠明

（江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214122）

固定化金屬親和層析富集麥胚蛋白金屬螯合肽的研究

王曉萍 郭曉娜 朱科學(xué) 彭 偉 周惠明

（江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214122）

利用3種蛋白酶（堿性蛋白酶Alcalase 2.4L、風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme 500MG和木瓜蛋白酶Papain）分別對(duì)麥胚蛋白進(jìn)行酶解，篩選金屬螯合率最高的酶解產(chǎn)物，再利用固定化金屬親和層析富集金屬螯合肽，并分析金屬螯合肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布和氨基酸組成。結(jié)果表明：在Alcalase 2.4L的酶解作用下，酶解時(shí)間200 min時(shí)，酶解產(chǎn)物的金屬螯合率達(dá)到最大值（69.62±0.96）%。以此麥胚蛋白酶解物通過(guò)固定化金屬離子親和層析富集得到的組分，相對(duì)分子質(zhì)量集中在180～2 000，谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的含量分別高達(dá)（22.64±1.50）%和（14.93±0.24）%。

麥胚蛋白 金屬螯合肽 固定化金屬親和層析 相對(duì)分子質(zhì)量 氨基酸組成

金屬螯合肽是指對(duì)Zn2＋、Fe2＋、Ca2＋等金屬離子具有螯合作用的生物活性肽。金屬螯合肽能作為運(yùn)輸鈣、鐵、鋅等微量元素的載體，提高微量元素的腸吸收效率和生物利用率。研究者已分別從鱭魚肌肉［1］、芝麻［2］、和羅非魚［3］等來(lái)源的蛋白酶解產(chǎn)物中分離出鐵、鋅和鈣螯合肽等。

小麥胚芽作為小麥粉加工的副產(chǎn)物，含有30%左右的蛋白質(zhì)，且氨基酸分布均衡，人體必需的8種氨基酸含量占總氨基酸的34.7%，是潛在的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源［4］。近年來(lái)，以麥胚蛋白為原料制備抗氧化肽［5］和抗緊張素抑制酶肽［6］等生物活性肽的研究得到了廣泛關(guān)注。然而，利用麥胚蛋白分離制備金屬螯合肽的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

固定化金屬離子親和層析（Immobilized Metal Ion Affinity，IMAC）是一種新型的分離技術(shù)，廣泛用于蛋白質(zhì)和肽的分離［7］。此方法利用蛋白質(zhì)或肽段表面的氨基酸與固定化金屬離子的親和力的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)特異性分離。因此，本研究采用固定化金屬離子親和層析富集麥胚蛋白源金屬螯合肽，并分析金屬螯合肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布與氨基酸組成，為金屬螯合肽的螯合機(jī)理提供借鑒，同時(shí)對(duì)深度開(kāi)發(fā)和利用麥胚蛋白，提高人民膳食營(yíng)養(yǎng)與健康水平，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂麥胚（蛋白質(zhì)：36.84%；脂肪：1.12%；水分：9.04%）：河南安陽(yáng)漫天雪有限公司；殼聚糖（脫乙酰度＞90%）：無(wú)錫華盛環(huán)?？萍加邢薰?；Alcalase 2.4L，F(xiàn)lavourzyme 500MG，Papain：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；Ferrozine，亞氨基二乙酸二鈉（IDA）：美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

KS－900脈沖式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波海曙科生儀器廠；CR 21GIII型高速冷凍離心機(jī)：HITACHI（日本）公司；冷凍干燥機(jī)：LABCONCO（美國(guó)）公司；HD－5電腦紫外檢測(cè)儀、BS－100A自動(dòng)收集器、DHL－B電腦數(shù)顯恒流泵：滬西（上海）分析儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Waters 600高效液相色譜儀：Waters（美國(guó)）公司；Agilentl100氨基酸分析儀：Agilent（美國(guó)）公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂麥胚中蛋白質(zhì)的提取

稱取一定質(zhì)量的脫脂麥胚粉溶于去離子水（10%，m／V），用1 mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)攪拌（低頻，30℃，30 min），離心（3 500 r／min，30 min），將離心所得沉淀重復(fù)上述超聲波輔助堿溶過(guò)程，合并2次上清液。用1 mol／L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至4.0，充分?jǐn)嚢?，離心（3 500 r／min，30 min），棄去上清液收集沉淀。用60%乙醇溶液洗滌沉淀3次，離心（3 500 r／min，30 min），取沉淀，冷凍干燥后得麥胚蛋白粉，置于干燥器中備用。

1.3.2 脫脂麥胚蛋白酶解物的制備

稱取一定質(zhì)量麥胚蛋白粉，用去離子水調(diào)配成5%（m／V）的懸浮液，加入蛋白酶并于其最適條件下酶解一段時(shí)間，反應(yīng)過(guò)程采用1 mol／L NaOH溶液維持體系pH值恒定。酶解反應(yīng)結(jié)束后，沸水中滅酶10 min，冰水冷卻后離心（4 000 r／min，30 min），收集上清液，微濾除去大分子雜質(zhì)，冷凍干燥得麥胚蛋白酶解物。各種酶的作用條件見(jiàn)表1。

表1 各酶的作用條件

1.3.3 金屬螯合率的測(cè)定

取5 mL樣品溶液（1mg／mL），加入2 mmol／L FeSO4·7H2O溶液100μL和5 mmol／L ferrozine溶液200μL，于漩渦振蕩器上振蕩反應(yīng)10 min，在562 nm下測(cè)定吸光值?？瞻滓匀ルx子水代替樣品。吸光值越低，表示金屬螯合能力越強(qiáng)。

金屬螯合率＝（1－A1／A0）×100%

式中：A1為樣品的吸光值；A0為空白的吸光值。

1.3.4 金屬螯合親和層析柱的制備

按照Shi等［8］方法制備IDA－殼聚糖填料。將制備好的IDA－殼聚糖填料裝柱（1.6 cm×30 cm），用雙蒸水流洗3個(gè)柱體積，接著用0.1 mol／L的Zn-SO4·7H2O溶液流洗4個(gè)柱體積，使填料充分吸附Zn2＋，再用雙蒸水洗去未結(jié)合的Zn2＋，得到Zn2＋－IDA－殼聚糖填料。用磷酸緩沖液（0.05 mol／L，pH 6.0）平衡金屬螯合親和層析柱，備用。

1.3.5 金屬螯合肽的富集

將麥胚蛋白酶解物（WGPH）用磷酸緩沖液（0.05 mol／L，pH 6.0）配成10mg／mL溶液，通過(guò)金屬螯合親和層析柱。上樣量5 mL，流速1 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，每5 min收集1管。先以雙蒸水洗去未結(jié)合的肽，再用含0.1 mol／L NaCl的磷酸緩沖液（0.1 mol／L，pH 6.0）洗脫出金屬螯合肽。收集各組分，冷凍干燥。

1.3.6 分子質(zhì)量分布測(cè)定

采用高效液相排阻色譜法進(jìn)行測(cè)定。高效液相色譜系統(tǒng)為Waters 600，色譜柱為TSK gel2 000 SWXL（7.8 mm×300 mm），流動(dòng)相為乙腈／水／三氟乙酸（45／55／0.1），流動(dòng)相為0.5 mL／min，柱溫30℃，采用紫外二極管陣列檢測(cè)器于220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。分別采用標(biāo)準(zhǔn)品乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（Mr189）、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（Mr451）、桿菌酶（Mr1 450）、抑肽酶（Mr6 500）和細(xì)胞色素（Mr12 500）進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的校正。

1.3.7 氨基酸組成分析

采用Agilentl100液相色譜法。稱取定量樣品，加入8 mL HCl溶液（6 mol／L），真空封口，在110℃下水解24 h，待冷卻后進(jìn)行轉(zhuǎn)移、定容、過(guò)濾、抽真空、過(guò)夜干燥。通過(guò)鄰苯二甲醛（OPA）柱前自動(dòng)衍生、氯甲酸芴甲酯（FMOC－Cl）與二級(jí)氨基酸（脯氨酸，羥脯氨酸）衍生聯(lián)用，經(jīng)高效液相色譜儀分析。樣品的氨基酸組成以色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性，以峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）形式表示，以方差分析ANOVA來(lái)檢測(cè)平均值之間的差異，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂麥胚蛋白酶解物的篩選

本試驗(yàn)選取Alcalase 2.4L、Flavourzyme 500MG和Papain 3種酶，在底物質(zhì)量濃度為5 g／100 mL，酶與底物比為1%，反應(yīng)溫度和pH值分別為各種酶的最適條件下進(jìn)行反應(yīng)，在不同水解時(shí)間取樣測(cè)定金屬螯合率，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。3種麥胚蛋白酶解物均有金屬螯合作用，并隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，金屬螯合率有先增大后減小的趨勢(shì)。這可能是由于在酶解的前期，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，越來(lái)越多的肽段被釋放出來(lái)，金屬螯合率不斷增大；而酶解后期，一些多肽繼續(xù)被降解，產(chǎn)生了一些游離氨基酸使金屬螯合率下降的緣故［2］。總的來(lái)看，Alcalase 2.4L水解物的金屬螯合率明顯強(qiáng)于Flavourzyme 500MG水解物和Papain水解物（P＜0.05）。酶的專一性使各酶切位點(diǎn)不同，酶解產(chǎn)物多肽的氨基酸組成及排列也不盡相同，這是影響肽的功能特性的主要因素。已有研究表明［9］，堿性蛋白酶對(duì)植物蛋白的羧端肽鍵有較強(qiáng)的專一性。Alcalase 2.4L酶解產(chǎn)物的金屬螯合率較其他大，可能與此有關(guān)。因此，采用Alcalase 2.4L進(jìn)行酶解反應(yīng)，并選擇200 min時(shí)的麥胚蛋白酶解產(chǎn)物（WGPH）進(jìn)行親和分離。

圖1 不同酶解條件下麥胚蛋白酶解物的金屬螯合率

2.2 固定化金屬親和層析分離麥胚蛋白金屬螯合肽

圖2所示為經(jīng)過(guò)分離后得到的未結(jié)合的肽（F1）和具有強(qiáng)結(jié)合能力的金屬螯合肽（F2）。金屬螯合肽（F2）的金屬螯合率為69.05%，而未結(jié)合的肽（F1）的金屬螯合率為－3.81%。此結(jié)果表明，固定化金屬親和層析可以有效富集麥胚蛋白金屬螯合肽。Chen等［10］利用固定化金屬親和層析從牡蠣蛋白水解物中分離出鋅結(jié)合能力不同的2種鋅螯合肽。因此，固定化金屬親和層析用于分離金屬螯合肽是可行的。

圖2 固定化金屬親和層析分離麥胚蛋白金屬螯合肽的分離譜圖

2.3 相對(duì)分子質(zhì)量分布變化

蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解可產(chǎn)生分子量不同的肽段，而多肽的生物活性與其肽鏈長(zhǎng)度有著密切的關(guān)系［11］。已有研究表明，相對(duì)分子質(zhì)量在180～2 000的麥胚多肽比大分子的肽段表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性［5］。為了進(jìn)一步探究金屬螯合率與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系，本試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)麥胚蛋白酶解物、金屬螯合肽等組分的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)固定化金屬親和層析分離后，相對(duì)于麥胚蛋白酶解物（WGPH），金屬螯合肽（F2）的相對(duì)分子質(zhì)量在500～2 000的比例有所提高，而未結(jié)合肽（F1）的相對(duì)分子質(zhì)量在＞2 000的比例大大增加，約為麥胚蛋白酶解物（WGPH）的10倍。比較金屬螯合肽（F2）和未結(jié)合肽（F1），在相對(duì)分子質(zhì)量＞2 000的分布范圍內(nèi)，未結(jié)合肽（F1）所占的比例遠(yuǎn)大于金屬螯合肽（F2）；而在相對(duì)分子質(zhì)量為180～1 000的分布范圍內(nèi)，金屬螯合肽（F2）所占的比例卻遠(yuǎn)大于未結(jié)合肽（F1）。由此可見(jiàn)，相對(duì)分子質(zhì)量太大的肽不容易吸附到固定化金屬親和色譜柱上，金屬螯合肽的相對(duì)分子質(zhì)量集中分布在180～2 000。Liu等［12］通過(guò)超濾將不同相對(duì)分子質(zhì)量分布的麥胚蛋白酶解物分開(kāi)，發(fā)現(xiàn)其中＜2 000的組分對(duì)鈣離子有很強(qiáng)的螯合性。Chen等［10］等將牡蠣蛋白酶解物通過(guò)固定化離子親和色譜、反相高效液相色譜等，分離純化出一條相對(duì)分子質(zhì)量為1 882的多肽，并證實(shí)其對(duì)鋅離子有較高的結(jié)合能力。

表2 相對(duì)分子質(zhì)量分布

2.4 氨基酸組成變化

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或肽中富含谷氨酸（Glu）或天冬氨酸（Asp）等氨基酸時(shí)，易與金屬離子結(jié)合，谷氨酸的γ－COO－和天冬氨酸的β－COO－是蛋白質(zhì)或肽與金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)［10，12－13］。由表3可以看出，經(jīng)固定化金屬親和層析分離后，天冬氨酸（Asp）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由（7.95±0.17）%提高到（14.93±0.24）%（P＜0.05），谷氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由（13.67±0.41）%提高到（22.64±1.50）%（P＜0.05）。固定化金屬親和層析高效地富集了含谷氨酸和天冬氨酸的金屬螯合肽。另外，酪氨酸（Tyr）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由（2.27± 0.01）%提高到（3.56±0.01）%（P＜0.05），酪氨酸（Tyr）殘基磷酸化后，其帶負(fù)電荷的磷酸集團(tuán)可與金屬離子結(jié)合［14］。蘇氨酸（Thr）的含量也明顯提高，蘇氨酸（Thr）的羥基通常也被認(rèn)為是肽或蛋白質(zhì)與金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)［1，15］。

從營(yíng)養(yǎng)學(xué)的角度看，經(jīng)固定化金屬親和層析富集得到的麥胚蛋白金屬螯合肽（F2），必需氨基酸種類齊全，且比例均衡，與WHO／FAO的推薦值較為接近，表明金屬螯合肽（F2）不僅能促進(jìn)微量元素的吸收，而且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用。金屬螯合肽（F2）中蘇氨酸（Thr）較豐富，如與蘇氨酸（Thr）含量較低的白米、小麥粉制品一起攝入可發(fā)揮不同食物蛋白質(zhì)之間的互補(bǔ)作用，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物利用率。

表3 氨基酸組成和構(gòu)成分布

3 結(jié)論

通過(guò)比較Alcalase 2.4L、Flavourzyme 500MG和Papain 3種酶酶解麥胚蛋白得到的酶解產(chǎn)物的金屬螯合率，得到利用堿性蛋白酶Alcalase 2.4L酶解麥胚蛋白200 min時(shí)的酶解產(chǎn)物具有最高金屬螯合率（69.92%）。將此酶解物通過(guò)固定化金屬離子親和色譜，可精確且有效地富集金屬螯合肽。對(duì)比麥胚蛋白酶解物，麥胚蛋白金屬螯合肽相對(duì)分子質(zhì)量在180～2 000分布范圍的比例有所提高；氨基酸組成中谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、酪氨酸（Tyr）、蘇氨酸（Thr）等可提供肽與金屬結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸含量均有不同程度的提高。由此可見(jiàn)，多肽的金屬螯合率與相對(duì)分子質(zhì)量和氨基酸組成有著密切聯(lián)系。

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Enrichment of Metal Chelating Peptides from Wheat Germ Protein by Immobilized－Metal Ion
Affinity Chromatography

WangXiaoping GuoXiaona Zhu Kexue Peng Wei Zhou Huiming
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Wheat germ protein has been hydrolyzed by three proteases（Alcalase 2.4L，F(xiàn)lavourzyme 500MG and Papain）respectively.The hydrolysateswith highestmetal chelating ability have been injected into immobilizedmetal ion affinity chromatography to enrich metal chelating peptides.The relativemolecularmass distribution and amino acid composition of themetal chelating peptideswere analyzed.The results showed that the hydrolysates could be obtained on condition as Alcalase 2.4L and 200 min，and the highestmetal chelating ability reached（69.62± 0.96）%.The relativemolecularmass ofmetal chelating peptides separated from wheatgerm protein hydrolysateswas concentrated in the range of180～2 000.Besides，themetal chelating peptides had high contentof Glu and Asp with the level of（22.64±1.50）%and（14.93±0.24）%respectively.

wheatgerm protein，metal chelating peptide，immobilized－metal ion affinity chromatography，relativemolecularmass，amino acid composition

TS209

A

1003－0174（2015）

國(guó)家自然科學(xué)基金（31101384），江蘇省自然科學(xué)基金（BK2011041）

2013－11－12

王曉萍，女，1988年出生，碩士，糧食、油脂與植物蛋白工程

朱科學(xué)，男，1978年出生，教授，谷物精深加工03－0101－05