半夏無菌組織培養(yǎng)體系建立中存在的問題和解決方法

張利霞， 孟彥斌

(隴南師范高等?？茖W校農(nóng)林技術(shù)學院，甘肅隴南 742500)

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半夏無菌組織培養(yǎng)體系建立中存在的問題和解決方法

張利霞， 孟彥斌

(隴南師范高等?？茖W校農(nóng)林技術(shù)學院，甘肅隴南 742500)

分析了建立半夏組培體系過程中存在的污染、次生代謝產(chǎn)物毒害、低成活率、再生方式多樣化的問題，提出了切實可行的解決方法，為對高效建立半夏組織培養(yǎng)體系的實踐提供依據(jù)。

半夏；組織培養(yǎng)體系；建立；問題；解決方法

半夏組織培養(yǎng)技術(shù)主要用于大規(guī)模繁殖半夏優(yōu)良品種和珍貴種質(zhì)資源，莖尖脫毒和無毒苗擴繁以及人工半夏種子生產(chǎn)中，其首要環(huán)節(jié)是建立無菌組織培養(yǎng)體系。建立半夏無菌組織培養(yǎng)體系，就要解決污染、次生代謝產(chǎn)物毒害、成活率低、再生方式多樣化的問題，筆者在此就這幾種問題的發(fā)生情況及解決方法進行了分析。

1 污染及其預防措施

污染可導致組織培養(yǎng)體系建立工作失敗，且引起污染的因素復雜多樣，所以半夏組織培養(yǎng)無菌體系建立中最為關(guān)鍵和困難的問題是防止污染發(fā)生。

1.1 污染原因 在組培半夏外植體建立中，引起污染的一類因素是外植體、消毒用容器、培養(yǎng)基、接種器械和接種室消毒不徹底，超凈工作臺過濾裝置失效，操作人員未遵守操作規(guī)程等，使得培養(yǎng)材料外部或培養(yǎng)基上帶有細菌、真菌等微生物，在培養(yǎng)最初的幾天內(nèi)培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基上滋生菌絲或菌落，不及時處理會使所有材料和整個培養(yǎng)基表面均受到感染。引起污染的另一因素是外植體攜帶內(nèi)生菌，培養(yǎng)初期并不表現(xiàn)污染，培養(yǎng)5 d后或更長時間才出現(xiàn)，污染程度較輕，但最難控制。在半夏外植體材料中，以塊莖尤其是生長結(jié)束后采收的塊莖引起的污染最為嚴重，珠芽的污染最輕。

1.2 污染的預防措施

1.2.1 接種環(huán)境嚴格消毒。接種室、培養(yǎng)室、超凈工作臺、消毒用容器、接種用器械、沖洗外植體材料所用的蒸餾水、工作人員的工作服和手都要嚴格消毒。筆者將沖洗外植體材料用的瓶裝蒸餾水、消毒外植體用的容器也用牛皮紙包扎好，用高壓鍋消毒，減少了污染。

1.2.2 選擇適宜的外植體及處理方法。在外植體材料的選擇上盡可能采用生長旺盛時期健壯母株的珠芽和塊莖，其帶菌少，啟動快，又較耐藥劑消毒處理。生長結(jié)束后的塊莖帶菌多，可先無土栽培塊莖，使其生長出珠芽，再以珠芽為外植體接種，能減輕污染。半夏外植體常規(guī)消毒方法是先用流水反復沖洗外植體，然后0.1%的升汞溶液處理材料10～15 min，用無菌水沖洗3次，再用70%～75%的酒精處理材料1 min，用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干外植體水后切割接種。對帶菌多消毒難的塊莖先要用0.5%的吐溫20浸塊莖材料1 h，期間更換新鮮液2～3次，后用常規(guī)消毒方法滅菌，再剝?nèi)テぃ?0%的次氯酸鈉溶液消毒30 min。材料消毒和沖洗的過程中要不斷攪拌材料，使藥劑或水和材料充分接觸。外植體材料消毒結(jié)束后，將其保留在消毒的容器中，瓶口對著酒精燈火焰的情況下對材料進行切割、接種。

1.2.3 分散培養(yǎng)。用試管分裝培養(yǎng)基，滅菌后，每支試管中接一個材料進行培養(yǎng)，5～15 d內(nèi)將無污染的材料轉(zhuǎn)接在誘導培養(yǎng)基中，可避免多個材料接在一個培養(yǎng)瓶中造成的交叉感染和浪費。也可在每試管中接一粒消毒后的塊莖或珠芽，培養(yǎng)一段時期后，剪取無污染材料的葉柄和葉片扦插組培。

1.2.4 應(yīng)用農(nóng)藥或抗生素抑制病原菌。組培體系建立過程中任何環(huán)節(jié)操作不慎就帶來污染，且外植體材料所帶內(nèi)生菌用前述的表面消毒方法難以殺滅，半夏塊莖和葉也不耐多次消毒，為此可以參考其他植物組培的相關(guān)研究成果，用抗生素或農(nóng)藥預處理外植體，然后進行常規(guī)消毒，或?qū)⒖股鼗虼温人徕c加入培養(yǎng)基中。彭廣霖等用含5～10 mg/L次氯酸鈉的培養(yǎng)基很好地抑制了組培中的枯草桿菌[1]?？股赜欣Ｆ健逼S西林鈉、慶大霉素、鏈霉素等，在不同的植物組培上用量在5～1 000 mg/L不等[2-4]。這些都值得借鑒，但在半夏組織培養(yǎng)中需要先進行試驗才能確定藥劑類型和劑量，原則上要能抑制微生物，不對外植體造成較大毒害，不造成過高培養(yǎng)成本。

單一的抗生素抑菌也單一，且易使菌類形成抗藥性，濃度高又影響植物生長，使用2種以上抗生素的效果較好。王志成等研究發(fā)現(xiàn)用60 mg/L米鮮胺和 300 mg/L氨芐青霉素或卡那霉素組合基本可抑制幾種材料的污染混合物[5]。田永亮等在葡萄組培初期用2種抗生素有效抑制了污染菌，隨后2種抗生素對污染菌均降低了抑制作用[6]，說明抗生素能抑制污染菌的生長，但不徹底殺滅污染菌，應(yīng)用中要注意這一現(xiàn)象。

2 次生代謝產(chǎn)物毒害及預防

2.1 次生代謝產(chǎn)物及其毒害 半夏的次生代謝產(chǎn)物有生物堿、β-谷甾醇、葡萄糖苷、半夏蛋白、脂肪酸[7]等，它們是半夏的生理活性成分，但在組培中對半夏生長和分化會起抑制作用。半夏中還含大黃酚[8]等酚類成分，在組織培養(yǎng)中可引起外植體褐化。筆者在半夏組培研究中發(fā)現(xiàn)，不加活性炭的MS培養(yǎng)基上半夏生長速度慢，愈傷組織小，分化的類原球莖少且小，組織容易老化；由于次生代謝產(chǎn)物的毒害使得土壤栽培半夏的輪作年限至少為5年。這是由于半夏在生長過程中不斷向周圍環(huán)境分泌次生代謝產(chǎn)物，環(huán)境中次生代謝產(chǎn)物的積累又反過來對半夏生長和發(fā)育起抑制作用。

2.2 次生代謝產(chǎn)物毒害的預防措施 用比較年幼健壯的珠芽、葉、塊莖作外植體，它們所含的次生代謝產(chǎn)物低，因而毒害小。以塊莖作為接種的外植體時切割的傷口不宜大，否則代謝產(chǎn)物溢出多，毒害大。切塊暴露在空氣中的時間不宜長，在培養(yǎng)基中暴露的組織也不宜多，以減少酚類氧化而發(fā)生褐化的機會。用不含激素的1/2MS +3%葡萄糖培養(yǎng)基為初代培養(yǎng)基，接種后在較低溫度和黑暗情況下進行初始培養(yǎng)[9]。培養(yǎng)基中加0.2%～0.3%的活性炭[10]，吸附次生代謝產(chǎn)物，預防次生代謝產(chǎn)物積累造成的毒害，且活性炭還能減輕外植體材料玻璃化，促進生根。對初代培養(yǎng)的材料及時轉(zhuǎn)接，縮短轉(zhuǎn)接周期，減少次生代謝產(chǎn)物的積累。

3 成活率和增殖率低及解決方法

3.1 成活率低的原因和表現(xiàn) 由于外植體受污染、次生代謝產(chǎn)物毒害、消毒創(chuàng)傷等原因，在初代培養(yǎng)時成活率低，具體表現(xiàn)為葉片枯萎，葉柄兩端水漬狀壞死，塊莖顏色變深組織變軟后失去生命能力。成活的外植體也多表現(xiàn)出低增殖率、產(chǎn)生的愈傷組織或類原球莖少。

3.2 提高成活率的措施 對外植體材料既要嚴格消毒以防帶菌，還要防止消毒過度而造成死亡。用生長旺盛時期的珠芽作外植體材料最為理想，成活率最高。以塊莖為外植體時在消毒后于1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幾天后頂芽萌發(fā)，周圍組織變綠，再進行切塊和轉(zhuǎn)接。塊莖和珠芽的切塊以頂端生長點為中心，輻射狀縱切，盡可能使每個材料均帶頂端組織，接種后成活率和增值倍數(shù)高，生長速度快。消毒后的葉柄去掉兩端損傷的部分，葉片剪掉邊緣然后接入培養(yǎng)基中容易成活和誘導。

4 再生方式多樣化及解決途徑

4.1 半夏再生方式 組培中半夏再生方式多樣化，一種是一步成苗，即從外植體上直接長出葉和根，形成完整的植株。用帶頂芽的塊莖和珠芽切塊作外植體多是這種再生方式。劉彩蓮試驗得出塊莖是誘導半夏一步成苗的最優(yōu)外植體，且最佳培養(yǎng)基及激素配比組合為MS+0.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA[11]。另一種再生方式是從半夏外植體材料上直接產(chǎn)生不定芽或類原球莖。這種方式基本不通過愈傷組織渠道，所以速度快、用時短、遺傳穩(wěn)定，但增殖率低，以葉柄、葉片誘導容易形成類原球莖。李先良等以葉片在MS+ 0.5 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基上誘導形成珠芽，但每個外植體僅能形成3.5個珠芽(類原球莖)[12]。第3種增值方式是外植體在創(chuàng)傷和激素誘導下先脫分化產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織上產(chǎn)生不定芽或類原球莖。由于愈傷組織細胞的分生能力強，故能分化出大量不定芽或類原球莖，極大地提高半夏繁殖系數(shù)，但遺傳穩(wěn)定性不能保證。陶米林等分析發(fā)現(xiàn)半夏頂芽愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L[13]。

4.2 半夏再生方式的利用 3種再生方式各有優(yōu)缺點，建立組培體系工作中要根據(jù)現(xiàn)有的材料、培養(yǎng)目的、外源激素的效應(yīng)等因素合理規(guī)避或加以利用。具體方法為：①一步成苗適用于篩選無菌苗，即將塊莖或珠芽用小容器分散培養(yǎng)成苗，選擇無菌苗，以其葉片、葉柄、珠芽為外植體重新進行誘導產(chǎn)生愈傷組織、類原球莖或不定芽。②從外植體材料上直接產(chǎn)生的類原球莖顏色深、結(jié)構(gòu)致密，容易發(fā)芽長成完整植株，可直接以類原球莖作為種子。因其增殖倍數(shù)小，所以在組培上要加大接種量以提高群體的產(chǎn)量。③通過愈傷組織的途徑產(chǎn)生的不定芽只能作為繼代培養(yǎng)的外植體，產(chǎn)生的類原球莖既可作為繼代培養(yǎng)的外植體，也可作為種子，因此通過選用適宜的外植體材料和激素組合的培養(yǎng)基引導愈傷組織朝需要的方向生長。愈傷組織太大浪費養(yǎng)分多，其上生長的不定芽或類原球莖體積小，所以也要控制激素含量以控制愈傷組織大小。④愈傷組織的細胞比其他的細胞容易發(fā)生變異，其中可能有染色體多倍性變異。多倍體一般比二倍體的個大，或內(nèi)含物多，表現(xiàn)為倍性效應(yīng)，多倍體半夏也容易通過無性繁殖固定下來，因此工作人員應(yīng)該經(jīng)常觀察，選擇優(yōu)良變異，將其培育成優(yōu)良品種。⑤同一外植體材料在同一種培養(yǎng)基中不一定只表現(xiàn)一種增殖方式，對管理和利用帶來一定的不便。要盡可能用同一種材料，選用最適宜的培養(yǎng)基，使半夏組織的生長步調(diào)相同。

5 結(jié)論

半夏組織培養(yǎng)體系的建立以防止污染和褐化、提高成活率為中心任務(wù)，通過選擇適宜的外植體材料和消毒方法，改進接種技術(shù)，改善培養(yǎng)條件，引導半夏組織再生方式，經(jīng)濟高效地建立無菌體系。半夏塊莖、珠芽、葉片、葉柄均可作為外植體，以旺盛生長時期的地上珠芽帶毒少，又耐消毒，成活率高，增值率高，是最為理想外植體。對接種環(huán)境嚴格消毒，對外植體適度、多重消毒，分散培養(yǎng)，既要消除污染，又要保證一定的成活率。用低濃度MS培養(yǎng)基，并添加活性炭，分步進行初始培養(yǎng)和誘導培養(yǎng)，縮短轉(zhuǎn)接時間，以減輕褐化。通過選擇外植體和外源激素，引導半夏再生方式朝需要的方向發(fā)展。

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張利霞(1965- )，女，甘肅西和人，副教授，從事植物組織培養(yǎng)和遺傳育種教學及研究工作。

2015-04-20

S 567.23+9

A

0517-6611(2015)17-082-02