反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液美拉德產(chǎn)物光譜特性和抗氧化活性的影響

許丹，龔燕丹，沈燕飛，聶小華

(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，食品科學(xué)與工程系，浙江 杭州，310014)

美拉德產(chǎn)物(MRPs)的抗氧化活性是國(guó)內(nèi)外食品領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。MRPs中含有類(lèi)黑精、還原酮以及一系列含N、S雜環(huán)化合物，具有抗氧化性能，其中某些物質(zhì)的抗氧化強(qiáng)度可與食品中常用的抗氧化劑相媲美［1］。Yilmaza等［2］發(fā)現(xiàn)組氨酸 -葡萄糖體系在100℃ 下加熱30 min，所得MRPs不具有抗氧化活性，而在120℃下反應(yīng)不同時(shí)間，MRPs的過(guò)氧化自由基值顯著增加;魯偉等［3］亦發(fā)現(xiàn)精氨酸-葡萄糖反應(yīng)體系的抗氧化能力隨著溫度的升高而逐漸增大。溫度會(huì)影響美拉德反應(yīng)路徑從而影響其產(chǎn)物的生成［4］。

對(duì)MRPs抗氧化活性的研究已獲得一些成果，但是多集中于還原糖-氨基酸模型系統(tǒng)，而采用蛋白酶解物來(lái)提供氨基與還原糖反應(yīng)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本文采用雞骨蛋白酶解液與半乳糖在不同反應(yīng)溫度下進(jìn)行美拉德化修飾，研究其MRPs光譜特性和抗氧化活性，并將其產(chǎn)物清除DPPH自由基能力、羥基自由基清除能力和還原能力與反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞骨架，市購(gòu)，去除脂肪、雞肉部分;D-半乳糖，上海伯奧生物科技有限公司;鄰菲羅啉，天津市福晨學(xué)試劑廠;DPPH，Sigma-Aldrich上海有限公司;其余試劑均為分析純，購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司;SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司;CU-600電熱恒溫水浴鍋，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞骨蛋白酶解液的制備

稱取一定量的雞骨架，加入1∶1.5(g∶mL)水后于130℃高壓蒸煮20 min，勻漿后冷卻至50℃加入復(fù)合酶(木瓜蛋白酶∶胰酶∶中性蛋白酶=1∶2∶1)200 g，酶解3.5 h后沸水浴滅酶，離心去沉淀，上清液即為水解度34%的雞骨蛋白酶解液。

1.2.2 雞骨蛋白酶解液MRPs的制備

將半乳糖添加到雞骨蛋白酶解液中，使之濃度達(dá)到2.4%，然后分裝于玻璃試管密封，于40、60、80、90、100℃下反應(yīng)90 min，反應(yīng)產(chǎn)物快速冷卻、離心，所得濾液即為雞骨蛋白酶解液MRPs。

1.2.3 褐變程度和中間產(chǎn)物的測(cè)定

將MRPs適度稀釋，分別于420 nm和294 nm下測(cè)定其吸光值。

1.2.4 內(nèi)源性熒光測(cè)定

以347 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm下測(cè)定MRPs的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 DPPH自由基清除率測(cè)定

采用Morales等人［5］的方法并稍作修改。將1.5 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液置于試管中，加入1.5 mL樣品液混勻，室溫下暗處放置30 min后，517 nm處測(cè)定其吸光值(Ai)。各組樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力用抑制率R表示。

式中，Ac:1.5 mL DPPH加入1.5 mL去離子水;Aj:1.5 mL乙醇加入1.5 mL樣品液。

1.2.6 羥基自由基清除率測(cè)定［6］

取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲溶液，依次加入0.4 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.4)，混合后加入0.6 mL 5 mmol/L FeSO4溶液，充分混勻，加入樣品2 mL以及0.4 mL 0.1%H2O2，于37℃水浴反應(yīng)60 min，536 nm處測(cè)定吸光度A。

式中，A損:以去離子水代替樣品;A未損:以去離子水代替樣品和H2O2。

1.2.7 還原能力測(cè)定

采用鐵氰化鉀法［7］。取2 mL待測(cè)樣品，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.6)和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，50℃水浴加熱20 min，迅速冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩搖勻后離心(3 000 r/min，10 min)。取2 mL上清液加入2 mL去離子水，0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，振蕩混勻后靜置10 min，700 nm處測(cè)定混合液吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 8.5及方差分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度和中間產(chǎn)物生成量的影響

褐變程度是判斷美拉德反應(yīng)進(jìn)入最終階段的一個(gè)重要指標(biāo)，常采用A420nm來(lái)檢測(cè)美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度。反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度影響如圖1所示。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度和中間產(chǎn)物生成的影響Fig.1 Effect of temperature on browning and intermediate products of MRPs

隨著反應(yīng)溫度的升高，雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度增大，顏色加深，40℃下其A420nm僅為0.26，100℃時(shí)則達(dá)到0.50，這是因?yàn)樽杂砂被鶊F(tuán)在較高溫度下更容易與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，促進(jìn)褐變反應(yīng)進(jìn)程［1］。

此外美拉德反應(yīng)過(guò)程中會(huì)形成大量的中間產(chǎn)物，從而進(jìn)一步聚合形成類(lèi)黑精等高分子褐色物質(zhì)，該中間產(chǎn)物在294 nm下有著明顯的紫外特征吸收峰。由圖1可知，雞骨蛋白酶解液MRPs的A294nm隨反應(yīng)溫度的增加而增大，說(shuō)明高溫下還原糖更容易發(fā)生脫水分解或裂解生成大量的中間產(chǎn)物［1］。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs內(nèi)源性熒光光譜的影響

美拉德反應(yīng)中形成的中間產(chǎn)物一般具有熒光特性，Baisier等［8］認(rèn)為熒光的積累是由于還原性化合物與胺類(lèi)之間相互作用發(fā)生了不可逆反應(yīng)而產(chǎn)生的。由圖2可知，雞骨蛋白酶解液MRPs在350 nm處有一個(gè)明顯的熒光吸收峰，且隨著反應(yīng)溫度增加顯著下降，推測(cè)其可能是蛋白質(zhì)中Phe、Trp或Tyr殘基所形成的;450 nm處亦有熒光吸收峰，符合美拉德產(chǎn)物的熒光特征，其熒光強(qiáng)度隨著反應(yīng)溫度的升高(40～80℃)而增加，而后隨著反應(yīng)溫度(90～100℃)的繼續(xù)升高而降低。較高的反應(yīng)溫度有利于美拉德反應(yīng)過(guò)程中熒光中間產(chǎn)物的形成和積累，但高溫下美拉德反應(yīng)越容易進(jìn)入終極階段，熒光中間產(chǎn)物相互間或與肽等聚合成高分子褐色物質(zhì)，導(dǎo)致其積累速率降低，這也符合Benjakul等［7］發(fā)現(xiàn)的熒光動(dòng)力學(xué)模式，即熒光強(qiáng)度先達(dá)到最大值而后降低。劉平等人在研究二甘肽-木糖美拉德反應(yīng)體系時(shí)亦發(fā)現(xiàn)了347 nm和430 nm兩處熒光吸收峰［9］。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs熒光光譜的影響Fig.2 Effect of temperature on flurorescence intensity of MRPs

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影響

反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影響如圖3所示。當(dāng)反應(yīng)溫度為40～60℃時(shí)，雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力較低，僅為46.49%(40℃);而反應(yīng)溫度高于80℃后，其產(chǎn)物清除DPPH自由基能力隨著反應(yīng)溫度的升高而顯著升高，可達(dá)到86.18%(100℃)。章銀良等［1］亦發(fā)現(xiàn)酪蛋白-木糖模式美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著反應(yīng)溫度的升高而增加;趙晶等［10］則分別研究了80～100℃下酪蛋白-葡萄糖MRPs、酪蛋白-乳糖MRPs的抗氧化活性，結(jié)果表明反應(yīng)溫度越高，MRPs對(duì)DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)。這是因?yàn)檩^高溫度下能生成較多的類(lèi)黑精、還原酮等物質(zhì)，這些物質(zhì)都具有清除DPPH自由基的能力［11］。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影響Fig.3 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of MRPs

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基能力的影響

從圖4可知，反應(yīng)溫度越高，雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基的能力則越大，從0.48%(40℃)增加到14.81%(100℃)。該研究結(jié)果與章銀良等［1］報(bào)道相一致。但 Vhangani等［12］在對(duì)核糖-賴氨酸和果糖-賴氨酸模擬體系MRPs進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同反應(yīng)溫度下形成的MRPs在清除羥基自由基方面并不存在顯著性差異。與DPPH自由基清除能力相比，雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基能力較低，這可能是由于MRPs金屬螯合能力干預(yù)了其羥基自由基清除能力［13］。Vhangani等［12］亦發(fā)現(xiàn)賴氨酸-糖模擬體系的DPPH自由基清除能力遠(yuǎn)大于其對(duì)羥基自由基的清除能力。

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs還原能力的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基能力的影響Fig.4 Effect of temperature on hydroxyl radical scavenging activity of MRPs

由圖5可知，雞骨蛋白酶解液MRPs有較好的還原能力，且還原能力隨著反應(yīng)溫度的升高而增強(qiáng)，其中100℃下還原能力是40℃下的3倍。Vhangani等［12］表明121℃下賴氨酸-果糖MRPs的還原能力遠(yuǎn)大于60℃下的還原能力;趙晶等［11］也發(fā)現(xiàn)100℃下酪蛋白-還原糖MRPs所呈現(xiàn)的還原能力最高。MRPs還原能力主要源于還原酮類(lèi)物質(zhì)和高溫下美拉德反應(yīng)形成的褐色高分子聚合物類(lèi)黑精，此類(lèi)物質(zhì)具有顯著的抗氧化性。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)雞骨蛋白酶解液MRPs還原能力的影響Fig.5 Effect of temperature on reducing power of MRPs

2.6 相關(guān)性分析

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物光譜特性與其抗氧化活性之間存在著一定的關(guān)聯(lián)［11］，兩者之間相關(guān)性分析如表1所示。雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力與褐變程度、A294nm變化有著較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.908 4和0.929 6，這與孟艷麗［11］、沈軍衛(wèi)［14］等人的結(jié)果相似。此外，雞骨蛋白酶解液MRPs的還原力與褐變程度、A294nm之間呈現(xiàn)正相關(guān)性，褐變程度越高和中間產(chǎn)物生成量越多，還原能力越強(qiáng)。Benjakul等［7］亦研究表明，豬血漿蛋白-糖 MRPs的還原力與褐變程度、A294nm之間顯著相關(guān)。但雞骨蛋白酶解液MRPs羥基自由基清除率與褐變程度、A294nm線性關(guān)系較差。

表1 MRPs的光譜特性和抗氧化活性間的相關(guān)分析Table 1 Correlation analysis betweenspectral characterisitics and antioxidant of MRPs

3 結(jié)論

對(duì)不同反應(yīng)溫度下雞骨蛋白酶解液-半乳糖MRPs進(jìn)行光譜特性和抗氧化能力分析，結(jié)果表明，MRPs褐變程度、中間產(chǎn)物生成量和熒光強(qiáng)度均隨著反應(yīng)溫度的升高而升高;MRPs的自由基清除能力和還原能力亦隨之反應(yīng)溫度的升高而增加，其DPPH自由基清除能力遠(yuǎn)大于羥基自由基清除能力，說(shuō)明雞骨蛋白酶解液-半乳糖MRPs具有良好的抗氧化活性。此外，MRPs的DPPH自由基清除能力和還原能力與其褐變程度、中間產(chǎn)物生成量有著良好的正相關(guān)性。

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