菜粉蝶對十字花科植物揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)及引誘劑配方的大田誘捕試驗

黃翠虹，游秀峰，王 玨，李為爭，閆鳳鳴*

(1.順德職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)藥衛(wèi)生學院，廣東順德 528333;2.河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，鄭州 450002)

植食性昆蟲通過多種感覺器官感知植物或植物花朵的顏色、形狀、花式、植物電場和香味，尋找到它們的食物(Clarke et al.，2013)，其中植物的揮發(fā)性氣味在昆蟲對于寄主植物的定向和選擇中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Visser，1986;Müller and Hilker，2000;閆鳳鳴，2011)。在明確昆蟲對植物揮發(fā)性成分反應(yīng)的基礎(chǔ)上，篩選和鑒定出活性化學成分并開發(fā)成誘劑，是害蟲安全治理的重要方向，對減少常規(guī)化學農(nóng)藥的使用進而防止害蟲抗藥性發(fā)展和保護環(huán)境具有重要意義。鱗翅目昆蟲幼蟲多數(shù)是農(nóng)林生產(chǎn)上的重要害蟲，是重點防控的對象，但幼蟲擴散能力差，通過揮發(fā)性活性成分制成的誘劑進行幼蟲種群控制的效果肯定會不理想，而通過調(diào)控成蟲的取食或產(chǎn)卵行為來抑制下一世代幼蟲的種群數(shù)量則是一條簡捷的思路(Li et al.，2005)。菜粉蝶Pireris rapae 偏好在十字花科植物上產(chǎn)卵，來自甘藍的多種揮發(fā)性成分如綠葉氣味(反-2-己烯醛，1-己醇和己醛)、苯乙腈、香葉烯和香葉醇都能激發(fā)菜粉蝶的EAG 反應(yīng)，但對破碎的甘藍組織或純的異硫氰酸酯類化合物表現(xiàn)出躲避反應(yīng)(Anderson et al.，2003)。苯乙醛、芳樟醇和氧代異佛爾酮等化合物還能激發(fā)其他鱗翅目昆蟲的GC-EAG(van Loon et al.，1992;Omura et al.，1999;Andersson，2003;Andersson，2003a，2003b;李為爭等，2003)，可能是引誘蝴蝶進行授粉的主要物質(zhì)(Andersson and Dobson，2003a，2003b)。由于試驗方法和化合物來源的障礙，當前國內(nèi)外研究多停留在“引誘”、“驅(qū)避”等定性的判斷上，而從“特征揮發(fā)物”(王英慧等，2010)的角度對植物氣味成分進行取舍，并確定各成分之間的交互作用的配方設(shè)計實驗尚未見報道。本研究以菜粉蝶為研究對象，利用經(jīng)過EAG 測試具有生理活性的11種十字花科揮發(fā)性化學物質(zhì)，采用配方均勻設(shè)計法(李云雁和胡傳榮，2009)，組配了一系列混合物，進行了連續(xù)3年的野外誘捕試驗，旨在為菜粉蝶的化學生態(tài)調(diào)控提供具有實用價值的引誘劑。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本研究室內(nèi)試驗在河南農(nóng)業(yè)大學化學生態(tài)實驗室進行;大田誘捕試驗于2009年6月10 日到7月10 日、2009年7月17 日到8月14 日、2010年9月1 日到10月23 日、2011年5月1 日到6月23 日在河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試昆蟲

于2008年從河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)甘藍田采集菜青蟲幼蟲，用甘藍葉在15 L∶9 D(暗期為23∶00-次日8∶00)、二級變溫(光期30℃±2℃、暗期28℃±2℃)、RH 70%的人工氣候箱中飼養(yǎng)，羽化后的成蟲飼以10%(v/v)蔗糖水。

1.2.2 供試試劑

根據(jù)現(xiàn)有文獻報導能引起菜粉蝶及鱗翅目昆蟲EAG 反應(yīng)(van Loon et al.，1992;Omura et al.，1999;Andersson，2003;Andersson，2003a，2003b;Andersson and Dobson，2003a，2003b;李為爭等，2003;王英慧等，2010)的植物氣味中選取11種十字花科植物含有的揮發(fā)性化合物作為供試試劑，其英文名稱和縮寫見表1。其中正己醇(EAG 參照物)、苯甲醇、苯乙酮購買于北京化學試劑公司;水楊酸甲酯、乙酸苯甲酯、苯乙醇購買于中國醫(yī)藥集團(上海)化學試劑有限公司;香葉醇購于Fluka 化學試劑公司;丁香酚、肉桂醛和水楊醛購于上海雙喜香料助劑廠;苯甲醛和苯乙醛購于Sigma-Aldrich 化學試劑公司，純度95%-99%。

1.3 試驗方法

1.3.1 觸角電位反應(yīng)測試

供試化合物除了乙醇外，其他化合物用石蠟油(天津科密歐公司)稀釋100 倍，正己醇用石蠟油稀釋相同的比例用作參照，溶劑石蠟油用作對照。分別測定菜粉蝶處女雄蝶、處女雌蝶的觸角電位。將觸角從基部切下，同時切去尖端少數(shù)幾節(jié)，放在記錄電極和參比電極之間，電極緩沖液為Kaissling 溶液(Li et al.，2005)。玻璃毛細管電極內(nèi)插Ag-AgCl 電極，與前置放大器(Syntech AC/DC UN-06)連接。放大的信號采用EAG 2000(Syntech)進行記錄并輸出到電腦。刺激物和濕潤的潔凈氣流(20 mL/s)通過兩個獨立管道吹送到離體觸角上，由刺激氣流控制器(Syntech CS-05)控制，供試樣品劑量為20μL，滴加在6 cm×0.5 cm 的濾紙條上，離觸角的距離為1 cm，刺激持續(xù)期為0.02 s，首先用參照和對照依次刺激，然后隨機抽取樣品進行刺激，完成一次循環(huán)之后仍然按該步驟進行，一根觸角可以做3-4個這樣的循環(huán)。刺激間隔期為30 s。每個樣品重復(fù)測定11 次。

1.3.2 誘芯配方設(shè)計

配方均勻設(shè)計是利用矩陣理論，只考慮試驗點在超體積空間均衡散布的試驗設(shè)計方法，試驗次數(shù)和因素水平數(shù)相等，利用多元回歸方法逐步剔除無關(guān)因素，獲得高效、簡易的配方(李云雁和胡傳榮，2009)。本試驗根據(jù)文獻中的配方均勻設(shè)計表(李云雁和胡傳榮，2009)，共制備了4 組配方，第1 組配方采用UM*12(127)對7種十字花科常見揮發(fā)性化合物苯甲醛、苯甲醇、乙酸苯甲酯、β-苯乙醇、肉桂醛、丁香酚和水楊酸甲酯進行誘捕活性考察;第2 組配方剔除苯甲醛和苯甲醇，采用UM*10(105)考察其他5種成分組成的10個配方的引誘活性;第3 組配方采用UM*10(105)考察水楊醛、乙酸苯甲酯、苯乙醛、香葉醇和苯乙酮5種成分的誘捕貢獻，第4 組配方在第3 組配方的基礎(chǔ)上去掉香葉醇和苯乙酮。配方中供試揮發(fā)物總劑量均為1000μL，各化合物按比例添加到8 mL 玻璃瓶中混勻，然后用2%瓊脂膠包結(jié)(Li et al.，2005)，置于4℃冰箱中備用。

1.3.3 大田誘捕實驗

大田實驗連續(xù)進行了3年，一共進行了4 次，每個時期每個配方均重復(fù)3 次，由于每個試驗階段田間氣溫差別較大，導致誘芯持效期不同，為了具有各階段的橫向可比性，表2 中已經(jīng)折算為每日釋放量(μL)。由于蝶類的視覺非常發(fā)達，在遠距離定向蜜源寄主時發(fā)揮著首要作用，尤其偏好亮黃色和藍色(Honda et al.，1998;Omura et al.，1999;Andersson，2003b)。為了避免這些偏好顏色對花香揮發(fā)物誘捕結(jié)果的影響，試驗采用市售的口徑24 cm 的不銹鋼水盆作為誘捕器，誘芯離水面的高度為1-3 cm，水盆中加滿水和少量洗衣粉，使得菜粉蝶的鱗片容易被浸潤，誘芯懸掛在田間直到每個試驗期結(jié)束為止。試驗水盆在田間竹竿三腳架上的懸掛高度為1.5 m，誘捕器間距為25 m，每個盆上用打價紙標簽編上編號貼在水盆側(cè)面便于識別和防止雨淋。采用完全隨機化區(qū)組設(shè)計，即分為3個試驗小區(qū)，每個小區(qū)中各個配方均出現(xiàn)1 次，在區(qū)組內(nèi)部則各個配方所在的誘捕器位置完全隨機化，每隔2-3 d 調(diào)查記錄一次所有誘捕器中的菜粉蝶數(shù)量，每次調(diào)查完各區(qū)組內(nèi)部誘捕器的位置重新隨機化排列一次。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 和SAS 進行統(tǒng)計分析，具體分析方法如下:

觸角電位反應(yīng)測試:首先用兩次參照之間的數(shù)值計算各個樣品和對照的矯正EAG 反應(yīng)值，計算方法是將相鄰兩次參照的差值計算:

其中，refi和refi+1表示相鄰兩次參照的實際EAG 反應(yīng)值，Trk為前一次參照刺激之后第K個刺激物的實際EAG 反應(yīng)值，CK 為按照上述方法校正后的反應(yīng)值，“12”表示兩次參照之間一共有12個樣品(包含對照)。然后采用單因素方差分析和Duncan's 多重比較法處理數(shù)據(jù)。

大田誘捕實驗:除了第4 組配方外，其他各個時期野外的菜粉蝶誘捕量均較少，因此將不同時期、不同重復(fù)的相同配方的誘捕數(shù)據(jù)合并處理，采用多元線性回歸方法判斷各種花香揮發(fā)物不同釋放量對菜粉蝶誘捕量影響的相對順序。針對有顯著影響的成分，將誘捕量數(shù)據(jù)與其劑量作圖，獲得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜粉蝶對花香氣味的觸角電位反應(yīng)

菜粉蝶成蟲對不同花香氣味揮發(fā)物的相對EAG 反應(yīng)結(jié)果如圖1 所示。從中可以看出，沒有任何一種花香氣味激發(fā)的EAG 反應(yīng)比用作參照的正己醇(一種綠葉氣味)更強。

表1 菜粉蝶成蟲對測試的花香揮發(fā)物的EAG 反應(yīng)及這些化合物的基本理化特性Table 1 Relative EAG values of Pireris rapae adults in response to different floral scents

2.2 大田誘捕試驗結(jié)果

采用配方均勻設(shè)計組合了4 組配方，于3個年份進行了野外誘捕試驗，結(jié)果匯總于表2-3，各時期配方中每日釋放量與菜粉蝶誘捕量較相關(guān)的成分的回歸分析結(jié)果見圖1 a-f?；ㄏ愠煞种凶畛Ｒ姷姆枷阕寤衔锉揭胰┖捅揭掖荚谄涔┰嚨呐浞街械暮颗c相應(yīng)時期的菜粉蝶累計誘捕量恒表現(xiàn)為線性正相關(guān)關(guān)系，其中苯乙醛的活性更強。然而，在2011年的誘捕中，苯乙醛每日釋放量在15μL 以下的配方菜粉蝶累計誘捕量非常低而且相近，而苯乙醛含量最大的配方(表3，2011年5月1 日-2011年6月23 日，配方編號1)誘捕量有了突然的增加，說明菜粉蝶對苯乙醛存在最低反應(yīng)閾值。水楊酸甲酯在2009年6月10 日-7月10 日的誘捕試驗中具有明顯引誘活性，但在2009年7月17 日-8月14 日的誘捕中與菜粉蝶誘捕量的關(guān)系不很明顯，其原因有待進一步探明。此外，苯甲醛和苯甲醇兩種物質(zhì)據(jù)室內(nèi)試驗報道(Andersson and Dobson，2003b)能夠激發(fā)菜粉蝶較強的喙伸展反應(yīng)，在野外誘捕結(jié)果中對這兩種化合物的在誘芯中的含量和菜粉蝶的誘捕量進行回歸統(tǒng)計顯示無顯著相關(guān)性。

表2 2009年使用的配方及各配方對菜粉蝶的累計誘捕量Table 2 Candidate lures used in 2009 and their cumulative trap catches of Pireris rapae

表3 2010年和2011年使用的配方及各配方對菜粉蝶的累計誘捕量Table 3 Blends used in 2010 and 2011 and their trap catches of Pireris rapae adults

續(xù)上表

3 結(jié)論與討論

本研究測試了菜粉蝶對常見花香氣味的EAG反應(yīng)并進行了大田誘捕，在室內(nèi)觸角電位反應(yīng)較強的乙酸苯甲酯和香葉醇，以及此前報道能引起菜粉蝶喙伸展反應(yīng)的苯甲醛、苯甲醇等物質(zhì)均是在大田誘捕中無效，而苯乙醛、苯乙醇和水楊酸甲酯在野外具有引誘菜粉蝶的作用。這種EAG 反應(yīng)結(jié)果與行為反應(yīng)不一致的現(xiàn)象此前也有許多報道(Honda et al.，1998;Omura et al.，2000;Andersson，2003)。

菜粉蝶成蟲對用作參照的正己醇(一種綠葉氣味)的EAG 反應(yīng)超過任何一種花香氣味物質(zhì)，這可能意味著菜粉蝶在長期進化過程中首先應(yīng)當學會尋找“綠色植物”，在這個前提下才能考慮其他因素，當然也可能與該化合物分子量最小、沸點最低有關(guān)。昆蟲對植物氣味的反應(yīng)不如信息素那樣專一和靈敏，各種植物揮發(fā)性化合物以不同濃度和配比能夠引發(fā)不同的行為反應(yīng)，用均勻配方設(shè)計方法對常見的十字花科植物氣味進行篩選，尋求誘導菜粉蝶的最佳配方在控制菜粉蝶危害上有重要的應(yīng)用意義。苯甲醛和苯甲醇兩種物質(zhì)據(jù)室內(nèi)試驗報道(Omura et al.，1999)能夠激發(fā)菜粉蝶較強的喙伸展反應(yīng)，在本實驗的大田誘捕結(jié)果中對這兩種化合物在誘芯中的含量和菜粉蝶的誘捕量進行回歸統(tǒng)計顯示無顯著相關(guān)性而苯乙醛和水楊酸甲酯誘捕效果較好。

苯乙醛、苯乙醇為最常見的花香化合物，這說明菜粉蝶可能對各種植物的花香氣味沒有明顯的選擇性。苯乙醛作為最關(guān)鍵的花香成分也能引誘許多鱗翅目的蛾類。花香氣味苯乙醛對棉鈴蟲Heliocoverpa armigera、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis 等多種蛾類具有引誘作用(Cunningham et al.，2006);茉莉花Cestrum nocturnum 所產(chǎn)生的揮發(fā)物對粉紋夜蛾Trichoplusia ni 有明顯的引誘作用，而且粉紋夜蛾晚上的取食時間與茉莉花產(chǎn)生香味的時間相一致，起取食引誘作用的主要成份為苯乙醛(Heath et al.，1992)。研究發(fā)現(xiàn)苯乙醛和α-蒎烯能夠誘導棉鈴蟲蛾的取食行為，苯乙醛和芳樟醇聯(lián)用能增強對棉鈴蟲蛾的引誘力(Cunningham et al.，2004，2006;Meagher and Landdolt，2010);花中的一些典型化合物如丁香醛的異構(gòu)體、反-β-羅勒烯以及芳香族化合物如苯甲醛、苯乙醛或藜蘆醚(鄰二甲氧基苯)對許多夜出性鱗翅目昆蟲具有引誘活性(D?tter et al.，2005);苯乙醛、乙酸苯甲酯和苯甲醛組成的配方比單用苯甲醛或空白誘捕器捕獲到更多的大豆夜蛾(Meagher，2002)。

圖1 配方中3種關(guān)鍵成分不同釋放速率對菜粉蝶誘捕量的影響Fig.1 Effect of different doses of three key components on the trap catch of Pireris rapae adults

Andersson 等(2003)采用13C 標記方法研究了菜粉蝶雌雄交尾過程中的物質(zhì)傳遞，發(fā)現(xiàn)水楊酸甲酯和吲哚是交尾過程中由雄蟲傳遞到雌蟲體內(nèi)的2種抗欲(anti aphrodisiac)活性的物質(zhì)，能夠降低交配后的雌蝶對其他雄性個體的引誘力，從而緩和精子競爭現(xiàn)象。這可能是由于水楊酸甲酯僅在與雌性信息素混合時才能起到抑制后者引誘活性的作用，或者與另一化合物吲哚混合時才能起作用，而獨立存在的水楊酸甲酯可能代表了一種花香氣味而不是“雄性的氣味”。在許多夜蛾類雄蟲的味刷中，也存在著各種花香氣味，例如甘藍夜蛾Mamestra brassicae 味刷中存在苯甲醇和苯乙醇，白腎灰夜蛾P(guān)olia persicariac 味刷中存在苯甲醇、苯乙醇和苯乙醛，蓓帶夜蛾 Mamestra configurata 的味刷成分是苯乙醇，灰夜蛾的味刷成分是苯甲醛、苯甲醇和苯乙醇。這些氣味可能具有引誘取食、雌雄近距離相遇后促進交尾、阻止其他雄蛾接近等功能(王蔭長，2004)。由于本試驗除了2011年各配方誘捕量較大，其他時期誘捕量較小，故未進一步分性比進行統(tǒng)計。

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