西花薊馬細(xì)胞色素P450 基因cDNA 片段克隆與mRNA 表達(dá)分析

董紅剛，謝志娟，杜予州，王建軍*

(1.揚(yáng)州市邗江區(qū)植保植檢站，江蘇揚(yáng)州 225009;2.泰州市靖江市植保植檢站，江蘇泰州 214500;3.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

西花薊馬Frankliniella occidentalis 是蔬菜、果樹(shù)和觀賞作物上重要害蟲(Kirk et al.，2003)，除了直接取食作物造成危害，還能傳播番茄斑萎病毒(TSWV)和鳳仙壞死斑點(diǎn)病毒(INSV)(Bielza，2008)，目前在歐洲、非洲、亞洲、美洲、大洋洲等69個(gè)國(guó)家和地區(qū)都有發(fā)生和危害報(bào)道。我國(guó)自從2003年7月在北京郊區(qū)保護(hù)地的辣椒和黃瓜上首次發(fā)現(xiàn)了西花薊馬的入侵為害以來(lái)(張友軍等，2003)，目前在山東、云南、貴州、浙江、湖南、江蘇、西藏等地都有西花薊馬發(fā)生的報(bào)道(鄭長(zhǎng)英等，2007;梁貴紅等，2007;袁成明等，2008;劉佳等，2010;嚴(yán)侃丹等，2010;王海鴻等，2013)，并呈進(jìn)一步傳播蔓延趨勢(shì)。目前防治西花薊馬仍以化學(xué)藥劑為主要手段，但由于化學(xué)藥劑的大量使用，已經(jīng)導(dǎo)致西花薊馬對(duì)有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯和多殺菌素等多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性(Bielza，2008;陳雪林等，2011)。

阿維菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素類廣譜高效殺蟲殺螨劑，也是防治西花薊馬的主要藥劑之一。Immaraju 等(1992)研究了美國(guó)加利福尼亞沿海地區(qū)西花薊馬田間種群對(duì)阿維菌素的抗藥性，發(fā)現(xiàn)加利福尼亞San Diego 和Santa Barbara 地區(qū)4個(gè)西花薊馬田間種群在LC90水平上對(duì)阿維菌素分別產(chǎn)生了18 倍、245 倍、798 倍和101 倍的抗性。最近，Chen 等(2011)對(duì)西花薊馬敏感品系進(jìn)行18 代15 次抗性選育，獲得了對(duì)阿維菌素具有45.5倍的西花薊馬抗性品系，增效實(shí)驗(yàn)和解毒酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，西花薊馬對(duì)阿維菌素的抗性可能與多功能氧化酶活性提高有關(guān)。本文在此基礎(chǔ)上克隆了5個(gè)屬于CYP4 家族的西花薊馬細(xì)胞色素P450酶基因cDNA 片段，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析了這5個(gè)基因在西花薊馬對(duì)阿維菌素抗性和敏感品系中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

西花薊馬相對(duì)敏感品系(ABA-S)由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所提供。該品系是2003年從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所的溫室甜瓜上采集的，在室內(nèi)未接觸任何藥劑的情況下用豆莢法長(zhǎng)期飼養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱飼養(yǎng)條件為:溫度27℃±1℃、相對(duì)濕度60%-75%、光周期L∶D=16 h∶8 h。西花薊馬相對(duì)抗性品系(ABA-R)由Chen 等(2011)對(duì)西花薊馬相對(duì)敏感品系(ABA-S)進(jìn)行阿維菌素抗性選育獲得。經(jīng)過(guò)18 代15 次抗性選育，獲得了相對(duì)于敏感品系對(duì)阿維菌素抗性倍數(shù)達(dá)45.5 倍的西花薊馬抗性品系。取生長(zhǎng)一致的相對(duì)敏感和抗性品系2 齡若蟲保存于-80℃待用。

1.2 主要試劑

pGEM-T vector 和SV total RNA isolation system購(gòu)自 Promega 公司，Ex TaqTMDNA 聚合酶、PrimescriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit 和SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit II 購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 總RNA 提取與cDNA 合成

相對(duì)敏感和抗性品系2 齡若蟲總RNA 的提取參照SV Total RNA isolation System 說(shuō)明書。RTPCR 和熒光定量RT-PCR 所用cDNA 模板的合成分別參照PrimescriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit和SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit II 操作說(shuō)明。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

根據(jù)昆蟲CYP4 保守性氨基酸殘基設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)。25μL PCR 反應(yīng)體系中含:14.5μL ddH2O;2.5μL 10×Ex TaqTMBuffer(Mg2+Free);2μL MgCl2(25 mM);2μL dNTPs(10 mM);1μL 上游/下游引物(10μM);1μL 8×Ex TaqTM聚合酶;1μL cDNA 模板。PCR 擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30s，52℃-41℃(每個(gè)循環(huán)降低1℃)退火30s，72℃延伸2 min，循環(huán)12 次;94℃變性30s，40℃退火30s，72℃延伸2 min，循環(huán)25 次;72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收和基因純化試劑盒純化后，克隆于pGEM-T vector 并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α 中，陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司用通用引物進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

利用Clustal W 進(jìn)行多重序列比對(duì)。利用Mega 5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)克隆獲得的5個(gè)西花薊馬CYP4 基因的cDNA 序列設(shè)計(jì)、合成熒光定量PCR 特異性引物(表1)。以Cifuentes 等(2012)報(bào)道的β-Actin 基因作為內(nèi)參基因。在20μL 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系中含有:SYBR Premix EX TaqTMII(2×)10.0μL、基因特異性上游引物(10μM)0.8μL、基因特異性下游引物(10μM)0.8μL、ROX Reference Dye II(50×)0.4μL、cDNA 模 板2μL，滅菌超純水6.0μL。在CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Bio-Rad，美國(guó))上按下列條件進(jìn)行反應(yīng):95℃預(yù)變性3 min，然后95℃變性10 s、60℃退火15 s 共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)以水為陰性對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)。反應(yīng)完成后收集Ct 值，并分析熔解曲線檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，對(duì)Ct 值采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析，用DPS 軟件進(jìn)行平均值與標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算。

表1 PCR 引物Table 1 Primers used in PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 西花薊馬CYP4 基因cDNA 片段的克隆

根據(jù)昆蟲CYP4 保守性氨基酸殘基設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增出5個(gè)CYP4 基因cDNA 片段，分別命名為CYP4-1、CYP4-2、CYP4-3、CYP4-4、CYP4-5，其中CYP4-1 和CYP4-4 核苷酸序列長(zhǎng)449 bp，編碼149個(gè)氨基酸;CYP4-2 和CYP4-3 核苷酸序列長(zhǎng)443 bp，編碼147個(gè)氨基酸;CYP4-5核苷酸序列長(zhǎng)446 bp，編碼148個(gè)氨基酸(圖1A和B)。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)基因在氨基酸水平的一致性在40%-76% 之間，并且都含有P450 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，如螺旋K 區(qū)的保守性基序EXXRXXP 和血紅素結(jié)合區(qū)的細(xì)胞色素P450 特征性基序FXXGXRXCXG(圖1B)。系統(tǒng)發(fā)生分析表明這5個(gè)基因都屬于CYP4 家族(圖2)。

2.2 西花薊馬CYP4 基因mRNA 表達(dá)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析了本文克隆的5個(gè)CYP4 基因在西花薊馬敏感和阿維菌素抗性品系2 齡若蟲中的mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果表明，抗性品系CYP4-1、CYP4-2 和CYP4-5 相對(duì)于敏感品系的表達(dá)倍數(shù)分別為3.50、4.00 和2.48 倍，但抗性品系與敏感品系CYP4-3 和CYP4-4 基因的表達(dá)水平不存在顯著差異(圖3)。

圖1 西花薊馬5個(gè)CYP4 基因的核苷酸(A)和氨基酸(B)序列比對(duì)Fig.1 Nucleotide(A)and amino acid sequence(B)alignment of five CYP4 genes in Frankliniella occidentalis

圖2 不同昆蟲細(xì)胞色素P450 系統(tǒng)發(fā)生Fig.2 Phylogenetic tree of cytochrome P450 proteins in different insect species

圖3 P450 基因在西花薊馬敏感和抗性品系中的表達(dá)分析Fig.3 The relative expression levels of P450 genes in susceptible and abamectin resistant strain of Frankliniella occidentalis

3 結(jié)論與討論

多功能氧化酶是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系，在對(duì)外源化合物的解毒代謝和殺蟲劑抗性機(jī)制中起著重要作用(邱星輝等，2003;Li et al.，2007)。Immaraju 等(1992)首次報(bào)道了美國(guó)加州4個(gè)西花薊馬溫室種群對(duì)氯菊酯的抗性可能與多功能氧化酶有關(guān)，在LC50和LC90水平上胡椒基丁醚(PBO)對(duì)氯菊酯的增效倍數(shù)分別達(dá)到2.7-20.0和8.3-50.2 倍。Espinosa 等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，PBO 對(duì)伐蟲脒、滅蟲威、氟丙菊酯、溴氰菊酯和甲胺磷等西花薊馬抗性選育種群分別具4.6、3.3、92.6、12.5 和14.3 倍的增效作用。Thalavaisundaram等(2008)研究發(fā)現(xiàn)，PBO 對(duì)2個(gè)對(duì)氟胺氰菊酯產(chǎn)生高水平抗性的澳大利亞西花薊馬田間種群的增效倍數(shù)分別達(dá)到266 和790 倍。王圣印等(2011)測(cè)定了西花薊馬抗吡蟲啉品系中多功能氧化酶3個(gè)組分的含量以及活性，發(fā)現(xiàn)在抗性品系中，細(xì)胞色素P450 含量是敏感品系的4.5 倍，細(xì)胞色素b5含量是敏感品系的4.23 倍，甲氧試鹵靈-O-脫甲基酶(MROD)活性是敏感品系的5.99 倍，表明多功能氧化酶在西花薊馬對(duì)吡蟲啉的抗性中發(fā)揮著重要作用。最近，Cifuentes 等(2012)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 研究發(fā)現(xiàn)，與敏感品系相比，抗性指數(shù)達(dá)932 倍的抗氟丙菊酯西花薊馬品系二齡若蟲和成蟲中CYP6EB1 和CYP6EC1均過(guò)量表達(dá)，說(shuō)明CYP6EB1 和CYP6EC1 可能與西花薊馬對(duì)氟丙菊酯抗性有關(guān)。這些研究表明，多功能氧化酶代謝活性的增強(qiáng)可能是西花薊馬對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性的共同機(jī)制。

阿維菌素是由土壤中灰色鏈霉菌Streptomyces avermitilis 發(fā)酵產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，是高效廣譜殺蟲殺螨劑，主要作用于γ-氨基丁酸受體和谷氨酸門控氯離子通道。Pu 等(2010)利用增效試驗(yàn)和解毒酶活性測(cè)定對(duì)一個(gè)具有23670 倍抗性的阿維菌素抗性選育小菜蛾品系(TH-Abm)的研究發(fā)現(xiàn)，多功能氧化酶活性提高是TH-Abm 品系對(duì)阿維菌素產(chǎn)生高水平抗性的重要機(jī)制。對(duì)煙粉虱的研究也發(fā)現(xiàn)多功能氧化酶與阿維菌素抗性相關(guān)(Wang et al.，2007)。最 近，Chen 等(2011)以西花薊馬敏感品系和對(duì)阿維菌素具有45.5 倍的西花薊馬抗性品系為材料，通過(guò)增效實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，酯酶抑制劑脫葉磷(DEF)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑馬來(lái)酸二乙酯(DEM)和PBO對(duì)西花薊馬相對(duì)敏感品系的增效倍數(shù)分別為0.77、0.84 和1.19 倍，對(duì)抗性品系的增效倍數(shù)分別為0.97、0.93 和3.00 倍，表明西花薊馬對(duì)阿維菌素的抗性可能與多功能氧化酶活性提高有關(guān)。進(jìn)一步測(cè)定了敏感品系和抗性品系這3種解毒酶活性，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于敏感品系，抗性品系多功能氧化酶活性提高了6.66 倍，但酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性沒(méi)有顯著差異。本文在此基礎(chǔ)上通過(guò)RT-PCR 獲得了5個(gè)屬于CYP4 家族的西花薊馬細(xì)胞色素P450 酶基因cDNA 片段，對(duì)這5個(gè)CYP4 基因的熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，阿維菌素抗性品系CYP4-1、CYP4-2 和CYP4-5 基因的mRNA 表達(dá)水平顯著高于敏感品系，相對(duì)表達(dá)倍數(shù)分別為敏感品系的3.50、4.00 和2.48 倍，表明西花薊馬對(duì)阿維菌素的抗性可能與這3個(gè)P450 基因的過(guò)量表達(dá)相關(guān)。

References)

Bielza P.Insecticide resistance management strategies against the western flower thrips，F(xiàn)rankliniella occidentalis［J］.Pest Management Science，2008，64(11):1131-1138.

Chen X，Yuan L，Du Y，et al.Cross-resistance and biochemical mechanisms of abamectin resistance in the western flower thrips，F(xiàn)rankliniella occidentalis［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2011，101:34-38.

Chen XL，Du YZ，Wang JJ，et al.Advance in insecticide resistance of the western flower thrips，F(xiàn)rankliniella occidentalis［J］.Plant Protection，2011，37(5):34-38.［陳雪林，杜予州，王建軍，等.西花薊馬抗藥性研究進(jìn)展［J］.植物保護(hù)，2011，37(5):34-38］

Cifuentes D，Chynoweth R，Guillén J，et al.Novel cytochrome P450 genes，CYP6EB1 and CYP6EC1，are over-expressed in acrinathrinresistant Frankliniella occidentalis(Thysanoptera:Thripidae)［J］.Journal of Economic Entomology，2012，105(3):1006-1018.

Espinosa PJ，Contreras J，Quinto V，et al.Metabolic mechanisms of insecticide resistance in the western flower thrips，F(xiàn)rankliniella occidentalis(Pergande)［J］.Pest Management Science，2005，61(10):1009-1015.

Immaraju JA，Paine TD，Bethke JA，et al.Western flower thrips(Thysanoptera:Thripidae)resistance to insecticides in coastal California greenhouses［J］.Journal of Economic Entomology，1992，85(1):9-14.

Kirk WDJ，Terry LI.The spread of the western flower thrips Frankliniella occidentalis(Pergande)［J］.Agricultural and Forest Entomology，2003，5(4):301-310.

Li X，Schuler MA，Berenbaum MR.Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics［J］.Annual Review of Entomology，2007，52:231-253.

Liang GH，Zhang HR，Li ZM，et al.Studies on the species of flower thrips and its occurence in Dounan Chenggong county of Yunnan［J］.Southwest China Joumal of Agricultural Sciences，2007，20(6):1291-1294.［梁貴紅，張宏瑞，李自命，等.云南花丼莉馬種類及發(fā)生研究［J］.西南農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，20(6):1291-1294］

Liu J，Zhang L，Lu YH，et al.Preliminary investigation of invasive pest of Frankliniella occidentalis in Hunan province［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2010，38(25):13800-13801.［劉佳，張林，盧焰梅，等.湖南外來(lái)入侵害蟲西花薊馬初步調(diào)查［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(25):13800-13801］

Pu X，Yang Y，Wu S.et al.Characterization of abamectin resistance in a field-evolved multiresistant population of Plutella xylostella［J］.Pest Management Science，2010，66(4):371-378.

Qiu XH，He FQ，Li M.Insecticide resistance mediated by cytochrome P450s in insects［J］.Chemistry of Life，2003，23(4):279-281.［邱星輝，何鳳琴，李梅.細(xì)胞色素P450 介導(dǎo)的昆蟲抗藥性［J］.生命的化學(xué)，2003，23(4):279-281］

Thalavaisundaram S，Herron GA，Clift AD.Pyrethroid resistance in Frankliniella occidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae)and implications for its management in Australia［J］.Australian Journal of Entomology，2008，47(1):64-69.

Wang HH，Lei ZR，Li X.An important invasive pest，F(xiàn)rankliniella occidentalis，inspected in Tibet［J］.Plant Protection，2013，39(1):181-183.［王海鴻，雷仲仁，李雪.西藏發(fā)現(xiàn)重要外來(lái)入侵害蟲-西花薊馬［J］.植物保護(hù)，2013，39(1):181-183］

Wang LH，Wu YD.Cross-resistance and biochemical mechanisms of abamectin resistance in the B-type Bemisia tabaci［J］.Journal of Applied Entomology，2007，131(2):98-103.

Wang SY，Liu YJ，Zhou XH，et al.Mechanisms of imidacloprid resistance in Frankliniella occidentalis［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2011，48(3):559-565.［王圣印，劉永杰，周仙紅，等.西花薊馬對(duì)吡蟲啉抗性機(jī)制的研究［J］.應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2011，48(3):559-565］

Yan DK，Tang YX，He ZY，et al.Survey in Nanjing and the PCR diagnosis of Frankliniella occidentalis［J］.Journal of Nanjing Agricultural University，2010，33(4):59-63.［嚴(yán)丹侃，湯云霞，賀子義，等.南京地區(qū)西花薊馬發(fā)生調(diào)查及其分子檢測(cè)［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(4):59-63］

Yuan CM，Zhi JR，Li JZ，et al.Investigation on the species of thrips in fields of vegetable in Guizhou Province［J］.China Plant Protection，2008，28(7):7-10.［袁成明，郅軍銳，李景柱，等.貴州省蔬菜薊馬種類調(diào)查研究［J］.中國(guó)植保導(dǎo)刊，2008，28(7):7-10］

Zhang YJ，Wu QJ，Xu BY，et al.The occurrence and damage of Frankliniella occidentalis(Thysanoptera:Thripidae):A dangerous alien invasive pest in Beijing［J］.Plant Protection，2003，29(4):58-59.［張友軍，吳青君，徐寶云，等.危險(xiǎn)性外來(lái)入侵生物-西花薊馬在北京發(fā)生危害［J］.植物保護(hù)，2003，29(4):58-59］

Zheng CY，Liu YH，Zhang NQ，et al.Invaded insect pest Frankliniella occidentalis first reported in Shandong Province［J］.Journal of Qingdao Agricultural University(Natural Science)，2007，24(3):172-174.［鄭長(zhǎng)英，劉云虹，張乃芹，等.山東省發(fā)現(xiàn)外來(lái)入侵有害生物-西花薊馬［J］.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，24(3):172-174］