高效液相色譜法測(cè)定飼料中左旋咪唑

吳荔琴， 林海丹*， 李小云， 鄧國(guó)東， 伍宏凱， 藍(lán)棋浩

（1.廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，廣東廣州 510230；2.廣東省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督總所，廣東廣州510230）

左旋咪唑（LMS）屬咪唑并噻唑類抗蠕蟲藥，臨床常用其鹽酸鹽或磷酸鹽。左旋咪唑具有廣譜、高效的特點(diǎn)，但該藥具有潛在的基因毒性，用藥后對(duì)消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液及造血系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和皮膚均有不同程度的毒副作用。左旋咪唑在國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用極為廣泛，當(dāng)長(zhǎng)期、超量用藥或不執(zhí)行休藥期規(guī)定時(shí)，或盲目用藥、重復(fù)用藥、配伍不當(dāng)時(shí)，均可產(chǎn)生殘留，直接危害人體健康。本研究建立了檢測(cè)配合飼料和濃縮飼料中左旋咪唑的高效液相色譜方法，該方法靈敏、高效、簡(jiǎn)便。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀，Aglient1100型，配UV檢測(cè)器，美國(guó)Aglient公司；分析天平，感量0.00001 g，CPA-225D型，德國(guó)賽多利斯公司；氮吹儀，GM-2100型，日本EYELA公司；超聲波清洗器，SB-5200DTDN型，寧波新芝公司；振蕩器，KS501型，馬來西亞IKA公司；離心機(jī)，5804R型，德國(guó)Eppendof公司；有機(jī)濾膜，孔徑為0.45 μm，天津市騰達(dá)過濾器件廠。

1.2 藥品與試劑 左旋咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥98.5%；乙腈、甲醇，均為色譜純，德國(guó)Merck公司；氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、正己烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；水為超純水，利用美?guó)Millipore超純水儀自制。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取左旋咪唑標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至 0.00001 g），于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 溶液配制 5 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉40 g，加水至200 mL，搖勻。0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉3.14 g，加水至1000 mL，搖勻。流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈溶液（75∶25，V/V）。

1.5 樣品制備

1.5.1 樣品提取 稱取適量飼料樣品 （配合飼料2 g、濃縮飼料1 g）于 50 mL離心管中，加適量水（配合飼料試樣10 mL、濃縮飼料5 mL），加5 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 mL，渦旋混勻1 min，超聲20 min，加入20 mL乙酸乙酯，振蕩30 min，6500 r/min離心5 min，取上清液5 mL于試管中，50℃氮?dú)獯蹈?，備用?/p>

1.5.2 樣品凈化 殘留物用2 mL流動(dòng)相溶解，加入正己烷2 mL，渦旋1 min，靜置分層，取下層溶液過濾膜上機(jī)測(cè)定。

1.6 色譜條件 色譜柱：SCX柱，柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，粒徑 5 μm；流動(dòng)相：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉乙腈-溶液（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；波長(zhǎng)：215 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.7 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定 按照信噪比S/N≥3時(shí)的添加濃度為檢測(cè)限，S/N≥10時(shí)的添加濃度為定量限，測(cè)定方法的檢測(cè)限和定量限。

1.8 添加回收率和精密度測(cè)定 選擇空白配合飼料、濃縮飼料樣品作為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。稱取適量飼料樣品于50 mL離心管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使配合飼料的添加濃度分別為 0.5、75、150、300 mg/kg， 濃縮飼料的添加濃度分別為 1、300、600、1200 mg/kg。 每個(gè)添加濃度設(shè)6個(gè)平行，進(jìn)行3次重復(fù)。當(dāng)樣品上機(jī)液的濃度超過線性范圍時(shí)，需稀釋后重新測(cè)定，直至上機(jī)液濃度在線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確移取左旋咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋配制成濃度為0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液， 過 0.45 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。以左旋咪唑藥物峰為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的回歸方程為Y=127.5C+1.973，r=1.0000。結(jié)果顯示，左旋咪唑濃度為0.1～50 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖1）。

圖1 左旋咪唑標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢測(cè)限和定量限 按照信噪比S/N≥3要求確定方法的檢測(cè)限，按照信噪比S/N≥10要求確定方法的定量限。結(jié)果表明，在配合飼料中的檢測(cè)限為0.2 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg；在濃縮飼料中的檢測(cè)限為0.4 mg/kg，定量限為1 mg/kg。

2.3 回收率和精密度 配合飼料濃度為0.5～300 mg/kg時(shí)，回收率為80.5%～102%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.6%～6.0%，批間變異系數(shù)為2.1%～4.8%；濃縮飼料濃度為1～1200 mg/kg時(shí)，回收率為80.1%～107%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.7%～9.8%，批間變異系數(shù)為2.0%～9.1%。配合飼料及濃縮飼料中左旋咪唑添加回收率測(cè)定結(jié)果見表1和表2；左旋咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2；代表性配合飼料和濃縮飼料空白添加樣品溶液色譜圖見圖3和圖4。

3 討論

3.1 液相色譜條件的優(yōu)化 測(cè)定左旋咪唑常用C18色譜柱進(jìn)行分離（林維宣等，2011；曾建亭等和曾勇等，2010），流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鈉（加二乙胺，用磷酸調(diào)pH值至7.5）-乙腈溶液（75∶25，V/V），紫外吸收波長(zhǎng)為 210 nm（曾勇等，2010）。經(jīng)測(cè)試，該條件下，樣品的基線峰波動(dòng)較大，雜質(zhì)干擾較多。左旋咪唑是極性較強(qiáng)的化合物，本方法采用強(qiáng)離子交換色譜柱 （SCX，250 mm×4.6 mm，粒直徑5 μm），流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈溶液，基線平穩(wěn)，雜質(zhì)干擾少。當(dāng)流動(dòng)相比例為75∶25（V/V）時(shí)，能把樣品溶液中雜質(zhì)峰和目標(biāo)藥物峰較好地分離。二極管陣列掃描最大吸收波長(zhǎng)為215 nm。其他液相條件為進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃。在該液相條件下，左旋咪唑最大吸收波長(zhǎng)為215 nm，見圖5。

表1 配合飼料中左旋咪唑添加回收率測(cè)定結(jié)果

圖2 左旋咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（20 μg/mL）

圖3 配合飼料空白添加色譜圖（0.5 mg/kg）

表2 濃縮飼料中左旋咪唑添加回收率測(cè)定結(jié)果

圖4 濃縮飼料空白添加色譜圖（1 mg/kg）

3.2 提取方法的確定 根據(jù)左旋咪唑的化學(xué)性質(zhì)，在堿性條件下，左旋咪唑有一定的質(zhì)子化傾向，可以促進(jìn)目標(biāo)物質(zhì)從飼料中提取。當(dāng)溶液為堿性時(shí)，左旋咪唑的電離受到抑制，在水相溶解度降低，易溶于鹵代烷、醚、酯類等弱極性有機(jī)溶劑。因此，飼料中左旋咪唑的提取思路是：先在飼料中加入一定量的水和氫氧化鈉溶液，使飼料和目標(biāo)藥物分散于堿性水溶液中，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。

圖5 左旋咪唑光譜圖

3.2.1 加堿量的確定 堿性環(huán)境的強(qiáng)弱會(huì)影響有機(jī)溶劑的提取效果。在加水后的飼料樣品中，若堿性環(huán)境太弱，左旋咪唑質(zhì)子化程度低，降低其在乙酸乙酯中的溶解度；但隨著氫氧化鈉溶液劑量的增加（當(dāng)pH值大于13），飼料中的脂肪成分會(huì)與多余的氫氧化鈉發(fā)生反應(yīng)，生成脂肪酸鈉，黏性越來越大，導(dǎo)致樣品不能與乙酸乙酯充分反應(yīng)，降低乙酸乙酯的提取效果。在配合飼料和濃縮飼料中分別加入 5 mol/L 的氫氧化鈉 0.1、0.2、0.3、0.5 mL，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，加入濃度為5 mol/L的氫氧化鈉溶液0.2 mL時(shí)，回收率最高。

3.2.2 提取劑的選擇 常用提取劑有：二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、異辛烷和乙酸乙酯?？紤]有機(jī)溶劑的毒性，比較提取過程中操作的難易程度和回收率的高低。結(jié)果顯示，回收率較高的是二氯甲烷和乙酸乙酯，均達(dá)到90%以上，但二氯甲烷麻醉性強(qiáng)，且太易揮發(fā)，分層后位于下層，不便于取出，因此選擇乙酸乙酯作為提取劑。

3.3 凈化方式的選擇 飼料樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，脂溶性雜質(zhì)較多的保留在樣品中，同時(shí)左旋咪唑是極性較強(qiáng)的化合物，在酸性水溶液中可用極性較低的有機(jī)溶劑進(jìn)行除脂，因此選擇常用有機(jī)溶劑正己烷進(jìn)行除脂。取5 mL乙酸乙酯提取液，置于50℃水浴中氮?dú)獯蹈桑儆? mL流動(dòng)相定容，并加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入2 mL正己烷，渦旋1 min，靜置，取下層溶液過濾膜，上高效液相色譜儀測(cè)定，觀察正己烷的除脂效果，測(cè)定定容液的pH值，并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，正己烷能有效除脂，定容液的pH值為5.8～6.0，樣品的平均回收率為99.5%。結(jié)果說明，堿化乙酸乙酯經(jīng)氮?dú)獯蹈珊髮?duì)流動(dòng)相定容液的pH值略有影響，由原來的4.78提高到了6.0，但仍為酸性條件，因此左旋咪唑是以離子形式存在于樣品復(fù)溶液中，正己烷的除脂操作并不會(huì)減少左旋咪唑的含量。

3.4 同類藥物的干擾 獸醫(yī)臨床常用的苯并咪唑類抗線蟲藥有：甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑以及芬苯達(dá)唑。應(yīng)用本方法色譜條件對(duì)上述三種藥物和左旋咪唑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑以及芬苯達(dá)唑的出峰時(shí)間分別為3.636、3.885、4.142 min，與左旋咪唑的出峰時(shí)間（15.361 min）相距較遠(yuǎn)，不會(huì)干擾左旋咪唑的測(cè)定。

3.5 添加濃度的確定 根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典 獸藥使用指南》（中國(guó)獸藥典委員會(huì)，2010）左旋咪唑內(nèi)服一次量，每千克體重，豬7.5 mg，禽25 mg，該藥物常用于生長(zhǎng)豬或生長(zhǎng)雞，根據(jù)飼喂畜禽的體重、日采食量，添加劑量約為150 mg/kg才有治療作用。根據(jù)《飼料中獸藥及其他化學(xué)物監(jiān)測(cè)試驗(yàn)規(guī)程》（全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)，2008），按照方法定量限及該藥物在臨床使用的有效劑量，確定配合飼料的添加濃度分別為0.5（定量限）、75、150、300 mg/kg。 濃縮飼料添加比例與配合飼料相比為8∶2，因此濃縮飼料的添加濃度分別為 1（定量限）、300、600、1200 mg/kg?；厥章蕦?shí)驗(yàn)中，當(dāng)樣品的上機(jī)液濃度超過線性范圍時(shí)，需稀釋后重新測(cè)定，直至上機(jī)液濃度在線性范圍內(nèi)。

4 結(jié)論

本研究建立了飼料中左旋咪唑的高效液相色譜檢測(cè)方法，采用堿性環(huán)境下乙酸乙酯提取，用正己烷除脂。該方法的回收率為80%～110%，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%，說明本方法能滿足飼料中左旋咪唑測(cè)定的要求。

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[2]全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)．GB/T 23182-2008[S]．飼料中獸藥及其他化學(xué)物監(jiān)測(cè)試驗(yàn)規(guī)程．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008-12-31．

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[5]中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典 獸藥使用指南[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社出版，2010．1：142～143.