桂花殘?jiān)锌傸S酮的提取及抗氧化作用研究

劉軍海， 李志洲， 王俊宏， 鄭 楠

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中 723000）

天然植物黃酮具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等生理作用，能夠維持腸道菌落平衡，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長，降低料肉比。除此之外，還具有類雌激素作用，可提高動(dòng)物繁殖能力，而且安全無毒（占今舜等，2014；陳佩佩等，2012）。 研究發(fā)現(xiàn)，桂花殘?jiān)泻胸S富的黃酮類化合物，如果將這一資源利用起來作為飼料添加劑的來源，不僅降低了飼料成本，也提高了桂花的綜合利用價(jià)值（朱沛沛等，2012；王麗梅等，2012）。本試驗(yàn)研究了微波預(yù)處理對酶解法提取桂花殘?jiān)傸S酮的影響，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝條件，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為桂花殘?jiān)傸S酮在飼料工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器 桂花殘?jiān)?，粉碎后恒溫干燥備用；蘆丁（中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，純度≥98%）；纖維素酶（15000 U/g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇、NaNO2、Al（NO）3、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、抗壞血酸、2，2-二苯代苦味?；诫禄―PPH）等均為分析純。

GR-200電子天平 （日本 AND）、pHS-3TC（0.01級）精密酸度計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）、WF-2000微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）、DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)箱（上海一恒科技有限公司）、Cary50型紫外可見分光光度計(jì)（美國瓦里安）、80-1型離心機(jī) （江蘇金壇正基儀器有限公司）、FW117中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）、SHZ-D9（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定總黃酮含量（王桃云等，2009）。精密稱取0.010 g在60℃烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容，配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分別移入7個(gè)25 mL的容量瓶中，先加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2，搖勻，靜置6 min，再加入 0.3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的 Al（NO3）3，靜置6 min，待溶液充分絡(luò)合，顏色不再變化后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH，最后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至刻度線，在510 nm處測定吸光度，分別以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液及測定的吸光度為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：

A=15.05C+0.0114，R2=0.9984；

式中：A為吸光度值；C為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，mg/mL。

1.2.2 桂花殘?jiān)傸S酮的提取 稱取備用的桂花殘?jiān)勰?.000 g，倒入50 mL錐形瓶中，加入60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇，移入微波反應(yīng)系統(tǒng)，根據(jù)設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行微波預(yù)處理后再加入緩沖液調(diào)節(jié)pH，在恒溫水浴槽中進(jìn)行酶解。酶解完成后得到的提取液經(jīng)過抽濾、離心，取上清液作為提取液的最終測定樣本測定桂花殘?jiān)傸S酮吸光度，計(jì)算提取率。

將測定的桂花殘?jiān)傸S酮的吸光度回代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中求出對應(yīng)的濃度C，按下式計(jì)算提取率。

桂花殘?jiān)傸S酮提取率/（mg/g）=VCX/W；

式中：V為測定液的體積；C為桂花殘?jiān)傸S酮測定樣品液濃度；X為桂花殘?jiān)傸S酮提取液稀釋總倍數(shù)；W為每次提取加入的桂花殘?jiān)|(zhì)量，g。

1.3 桂花殘?jiān)傸S酮的抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.1 清除羥自由基活性研究 參照陳佳等（2011）和孟娜（2014）的方法，將微波預(yù)處理酶法最佳工藝條件下提取的桂花殘?jiān)傸S酮提取液配制成不同質(zhì)量濃度梯度的溶液8份，相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為對比，每個(gè)質(zhì)量濃度的提取液均取2.00 mL移入25 mL的容量瓶中，依次加入6.0 mmol/L的硫酸亞鐵 2.0 mL，1.0 mmol/L的雙氧水2.0 mL混合均勻，靜置10 min后再加入6.0 mmol/L的水楊酸2.0 mL，反應(yīng)30 min于510 nm處測定吸光度，記為A0；用雙氧水代替水楊酸測得的吸光度記為A1；以蒸餾水代替提取液所測得的吸光度記為A2。每次試驗(yàn)重復(fù)三次，以其平均值作為最終的試驗(yàn)值，按下式計(jì)算清除率：

羥自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100。

1.3.2 清除DPPH自由基活性研究 參照孟娜等（2014）和丁振柱（2011）的方法，將微波預(yù)處理酶法最佳工藝條件下提取的桂花殘?jiān)傸S酮提取液配制成不同質(zhì)量濃度梯度的溶液8份，每個(gè)質(zhì)量濃度的溶液均取2.0 mL移入10 mL的具塞試管中，再加入2.0 mL濃度為0.06 mg/mL的DPPH自由基溶液（用60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解0.06 mg的DPPH自由基，轉(zhuǎn)移到100 mL棕色的容量瓶中定容），混合均勻后反應(yīng)30 min，于4000 r/min離心10 min，取上清液在波長517 nm處測定吸光度，記為A0；另移取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的總黃酮溶液于10 mL的具塞試管中，分別加入無水乙醇2.0 mL，在波長517 nm處測定其吸光度，記為A1；以2.0 mL 0.03 mg/mL的DPPH自由基溶液和2.0 mL無水乙醇反應(yīng)作為參比測定吸光度，記為A2；以抗壞血酸作為對照。每個(gè)試驗(yàn)平行測定三次，取平均值作為最終試驗(yàn)數(shù)據(jù)。按下式計(jì)算清除率：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100。

1.4 正交試驗(yàn)因素與水平 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取試驗(yàn)所涉及的5個(gè)單因素作為影響因子，桂花殘?jiān)傸S酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步考察酶法提取桂花殘?jiān)傸S酮中酶解時(shí)間、纖維素酶用量、料液比、pH及酶解溫度對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響，并優(yōu)化篩選出最佳提取工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 微波預(yù)處理對酶法提取桂花殘?jiān)傸S酮的影響 稱取1 g桂花殘?jiān)勰┓湃?0 mL的錐形瓶中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，轉(zhuǎn)入微波反應(yīng)系統(tǒng)中預(yù)處理1 min，微波溫度50℃，微波功率300 W。預(yù)處理后移出，加入纖維素酶8 mg，調(diào)節(jié)pH=6，在50℃條件下酶解。桂花殘?jiān)傸S酮提取率在微波預(yù)處理和未經(jīng)微波預(yù)處理情況下隨酶解時(shí)間延長的變化結(jié)果如圖1所示。

圖1 微波預(yù)處理對桂花殘?jiān)傸S酮提取效果的影響

由圖1可以看出，與未經(jīng)微波預(yù)處理組相比，微波預(yù)處理組不僅提取率高而且縮短了提取時(shí)間。微波預(yù)處理組酶解40 min的提取率和未經(jīng)預(yù)處理組酶解90 min的提取效果基本相當(dāng)，微波預(yù)處理組酶解60 min時(shí)提取率最高達(dá)到25.19 mg/g，而未經(jīng)微波預(yù)處理酶解60 min提取率僅為17.33 mg/g。微波輻射能加快分子熱運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)的壓強(qiáng)不斷增大最終破壞細(xì)胞壁，再經(jīng)過充分酶解，桂花殘?jiān)械目傸S酮更易溶出而被提取出來。微波預(yù)處理對酶解過程具有一定的協(xié)同及促進(jìn)作用。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 纖維素酶用量對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響 稱取1 g桂花殘?jiān)勰┓湃?0 mL的錐形瓶中，加入25 mL的體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，添加不同量的纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)pH=6，在50℃條件下酶解60 min，考察纖維素酶用量對桂花殘?jiān)傸S酮提取量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 纖維素酶用量對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響

纖維素酶能破壞桂花殘?jiān)募?xì)胞壁，有助于總黃酮的溶出。由圖2可知，纖維素酶用量在10 mg時(shí)桂花殘?jiān)锌傸S酮的提取率最大，這主要是因?yàn)槔w維素酶添加量較少，桂花殘?jiān)募?xì)胞壁破壞不完全，黃酮不能全部釋放出來；纖維素酶添加量較多進(jìn)一步促進(jìn)了破壁效果，各種醇溶性雜質(zhì)競相溶出，但同時(shí)也容易和桂花殘?jiān)械亩嗵穷愇镔|(zhì)黏附，堵塞總黃酮的部分溶出通道，因此提取率減小，故10 mg纖維素酶的效果最好。

2.2.2 料液比對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響 稱取1 g桂花殘?jiān)勰┓湃?0 mL錐形瓶中，配制成不同的料液比，添加8 mg纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)pH=6，在50℃條件下酶解60 min，考察料液比對桂花殘?jiān)傸S酮含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響

由圖3可知，并不是料液比越大提取率越高。料液比在1∶35 g/mL時(shí)桂花殘?jiān)傸S酮的提取率最大，料液比小，一方面?zhèn)髻|(zhì)速率小，另一方面酶在提取劑中分散空間有限容易黏結(jié)，活性受到影響，因此提取效果不好；料液比增大溶劑消耗量大且提取率增幅不明顯，對于優(yōu)化工藝來說沒有太大意義，1∶25～1∶35 g/mL 桂花殘?jiān)奶崛÷时容^接近，綜合考慮提取成本及提取率，選擇1∶25g/mL為最佳料液比。

2.2.3 pH對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響 稱取1 g桂花殘?jiān)勰┓湃?0 mL的錐形瓶中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，添加8 mg纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)為不同的pH，在50℃條件下酶解60 min，考察pH對桂花殘?jiān)傸S酮含量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響

纖維素酶的活性高對應(yīng)的桂花殘?jiān)傸S酮提取率就高，pH是影響纖維素酶活性的重要因素。由圖4可知，弱酸環(huán)境對纖維素酶活性的影響非常明顯，桂花殘?jiān)傸S酮在pH=6時(shí)提取率最高，偏堿性的環(huán)境中纖維素酶容易失活，總黃酮的提取效果不好，因此，提取時(shí)選擇pH=6較好。

2.2.4 酶解溫度對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響稱取1 g桂花殘?jiān)勰┓湃?0 mL的錐形瓶中，加入25 mL的體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，添加8 mg纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)pH=6，在不同溫度條件下酶解60 min，考察酶解溫度對桂花殘?jiān)傸S酮含量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解溫度對桂花殘?jiān)傸S酮提取率的影響

溫度是酶解過程中一個(gè)重要的影響因素，酶在適宜的溫度下才會(huì)有效地進(jìn)行酶解反應(yīng)。由圖5可知，桂花殘?jiān)傸S酮提取率隨酶解溫度的升高先增大后減小，60℃時(shí)提取率最高。低溫不足以激發(fā)纖維素酶的活性，高溫又容易使纖維素酶失活而且能耗高，因此選擇60℃作為較佳的酶解溫度。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 以酶解時(shí)間、纖維素酶用量、料液比、pH、酶解溫度為正交試驗(yàn)的5個(gè)影響因子，桂花殘?jiān)傸S酮提取率為指標(biāo)，通過L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化酶法提取桂花殘?jiān)傸S酮的提取工藝。 結(jié)果如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，pH對酶法提取桂花殘?jiān)傸S酮影響最大，其余依次為酶解溫度、酶解時(shí)間、纖維素酶用量及料液比。pH和酶解溫度影響纖維素酶的活性，直接決定桂花殘?jiān)傸S酮的提取，因此在試驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制，合理調(diào)節(jié)。正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：酶解70 min，纖維素酶用量8 mg，料液比 1∶30 g/mL，pH=6，酶解溫度 60 ℃。由于正交試驗(yàn)中無此組合，因此要對其進(jìn)行驗(yàn)證。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，所得提取率分別為 26.416、26.183、26.274 mg/g， 效果優(yōu)于其他組合的提取率，故取其平均值26.291 mg/g為正交優(yōu)化條件下的最終提取率。

2.4 桂花殘?jiān)傸S酮提取液性質(zhì)研究

2.4.1 抗氧化活性研究

2.4.1.1 清除羥自由基活性 由圖6可知，總黃酮和抗壞血酸對羥自由基的清除效果均與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系，總體來看，桂花殘?jiān)傸S酮提取液清除羥自由基能力不及抗壞血酸，高濃度時(shí)的桂花殘?jiān)傸S酮提取液對羥自由基的清除能力接近抗壞血酸，具有較好的抗氧化活性。桂花殘?jiān)傸S酮提取液質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時(shí)清除羥自由基能力大于抗壞血酸，低濃度的桂花殘?jiān)傸S酮提取液清除羥自由基能力與抗壞血酸相比沒有優(yōu)勢。

圖6 羥自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1.2 清除DPPH自由基活性 由圖7可知，濃度在0.04～0.06 mg/mL，桂花殘?jiān)傸S酮提取液清除DPPH自由基能力強(qiáng)于抗壞血酸。低濃度范圍內(nèi)，隨著總黃酮提取液質(zhì)量濃度的增大，DPPH自由基的清除率增長較快，濃度大于0.14 mg/mL之后清除率基本不變，而大于此濃度的抗壞血酸的清除率依然繼續(xù)增大，最大清除率達(dá)到91.016%，桂花殘?jiān)傸S酮提取液對DPPH的最大清除率為77.472%。雖然桂花殘?jiān)傸S酮提取液清除DPPH自由基能力整體沒有抗壞血酸好，但還是具有一定的清除DPPH自由基能力。

3 結(jié)論

圖7 DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

3.1 微波預(yù)處理能縮短酶法提取桂花殘?jiān)傸S酮的提取時(shí)間，同時(shí)提取率也得到大幅度的提升。正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：酶解時(shí)間70 min，纖維素酶用量 8 mg，料液比 1∶30 g/mL，pH=6，酶解溫度60℃，此條件下的提取率為26.291 mg/g。

3.2 桂花殘?jiān)傸S酮提取液對DPPH自由基和羥自由基均有很強(qiáng)的清除能力，作為飼料抗氧化劑能減少因自由基引發(fā)疾病的發(fā)病率，提高禽畜機(jī)體免疫力.

注：因版面所限參考文獻(xiàn)省略，如有需要，可來函索取。電子郵箱：iamliujunhai@126.com