響應(yīng)曲面法優(yōu)化木香有效成分的微波輔助提取工藝

張 玲，李 麗，王金莉

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

木香為菊科云木香屬植物木香的干燥根，具有調(diào)中宣滯，行氣止痛，解痙、松弛平滑肌、抗炎等作用，獸醫(yī)臨床常用其改善反芻動(dòng)物瘤胃環(huán)境，治療瘤胃積食（魏華，2012）。木香主要的活性成分為木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，均屬于倍半萜內(nèi)酯，是木香質(zhì)量控制的主要指標(biāo) （國(guó)家藥典委員會(huì)，2010）。響應(yīng)面分析法（RSM）是利用中心組合試驗(yàn)擬合出完整的二次多項(xiàng)式模型以優(yōu)化工藝條件的方法（Li，2005）。通過(guò)求出的最佳參數(shù)，使得試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表達(dá)更加優(yōu)良，最優(yōu)組合條件也更直觀、更精確（范東斌等，2014；王萬(wàn)中，2004）。 本研究采用微波輔助提取法提取木香中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，動(dòng)用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 LC-10A高效液相色譜儀（日本島津株式會(huì)社）、EZChrom色譜工作站、UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津株式會(huì)社）、水浴鍋（天津中環(huán)科技電子公司）、BP121S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）、DFY-200型粉碎機(jī)（溫嶺大德中藥粉碎廠）、微波提取裝置HWC-10B（廣州興興微波設(shè)備有限公司）。

1.1.2 試藥 木香，購(gòu)自甘肅隴原中藥材開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司；木香烴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所（批號(hào)：111524-201203）；去氫木香內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所 （批號(hào)：111525-201205）；乙醇為醫(yī)用級(jí)；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；水為雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測(cè)定

1.2.1.1 對(duì)照品的制備 分別取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱取，加甲醇溶解，分別配制成每毫升中含1 mg木香烴內(nèi)酯和1 mg去氫木香內(nèi)酯的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別從其中精密吸取1 mL至量瓶中，加甲醇定容至10 mL，即得含有木香烴內(nèi)酯（100 μg/mL）和去氫木香內(nèi)酯（100 μg/mL）的混合對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用HPLC分析1.2.1.1中的混合對(duì)照品溶液，采用ZORBAX SBC18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μ），流動(dòng)相為甲醇-水（65∶35），檢測(cè)波長(zhǎng)為 225 nm，流速為 1 mL/min，進(jìn)樣量為 3、5、10、15、20、25、30、35 μL，測(cè)得峰面積積分值。以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯回歸方程和線性范圍：

Y=0.263X-6.435（r=0.9995）；

進(jìn)樣量為72.42～914.07 ng時(shí)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

1.2.1.3 木香有效成分的提取及提取率計(jì)算 參考錢(qián)偉（2013）的提取方法，取木香飲片，適當(dāng)粉碎，精密稱取3.0 g木香，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，靜置12 h，選取適當(dāng)微波功率和提取時(shí)間，損失的重量用甲醇補(bǔ)足，放冷，濾過(guò)。按1.2.1.2項(xiàng)的測(cè)定方法，結(jié)合回歸方程計(jì)算得到木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的質(zhì)量，再計(jì)算提取率：

提取率=提取液中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的質(zhì)量/投藥量×100。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)分別選取微波功率、提取時(shí)間和料液比作為考察的單因素，按照1.2.1.3方法提取，并計(jì)算提取率。

1.2.2.1 微波功率對(duì)提取率的影響 在提取時(shí)間7 min、料液比 1∶15（g/mL）的條件下，研究微波功率（200、300、400、500、600 W）對(duì)提取率的影響。

1.2.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 在微波功率400 W、料液比 1∶15（g/mL）的條件下，研究提取時(shí)間（3、5、7、9、12 min）對(duì)提取率的影響。

1.2.2.3 料液比對(duì)提取率的影響 在微波功率400 W、提取時(shí)間7 min的條件下，研究料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]對(duì)提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)水平基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以提取率（Y）為響應(yīng)值，選取微波功率（W）、提取時(shí)間（min）和料液比（g/mL）三個(gè)影響因素，利用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)（張百霞，2013）。因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)提取率的影響 由圖1可見(jiàn)，隨微波功率的增加，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率逐漸增大，當(dāng)微波功率達(dá)到400 W時(shí)，二者的提取率最高，之后逐漸下降，故考慮選用400 W微波功率為宜。

圖1 微波功率對(duì)提取率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率也隨之增大，在9 min時(shí)達(dá)到最大。隨著微波時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，提取率則有所下降?？紤]選擇微波時(shí)間為9 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)提取率的影響 由圖3可知，隨著料液比的升高，兩種成分的提取率逐漸增加，但當(dāng)料液比超過(guò)1∶15（g/mL）以后，提取率又迅速下降，故選擇 1∶15（g/mL）的料液比為宜。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn) 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)的取值見(jiàn)表2，共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（3個(gè)中心點(diǎn)）用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差（何力等，2010）。每次木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)曲面優(yōu)化工藝方案及結(jié)果

2.2.1 回歸方程 利用軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到模型的二次多元回歸方程。

提取率 （Y）/%=2.12+0.015A+3.750×10-3B+0.035C-9.804×10-4AB-0.025AC-0.017BC-0.14A2-0.10B2-0.060C2。

2.2.2 回歸模型方差分析 對(duì)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。模型的P＜0.01；模型的校正確定系數(shù)R2＞0.95；料液比的一次項(xiàng)和三個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)木香提取物的提取率有顯著影響（P＜0.05）；微波功率、提取時(shí)間的一次項(xiàng)和三個(gè)因素的交互項(xiàng)對(duì)兩種物質(zhì)提取率的影響不顯著。

回歸模型的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖4。圖4a表明，當(dāng)提取時(shí)間比較短時(shí)，微波功率對(duì)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率的影響比較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，微波功率增大，提取率先增高后降低。圖4b表明，兩種物質(zhì)的提取率隨著微波功率和料液比的增加先快速增加，而后略有減小，等高線圖表明，兩因素的交互作用較強(qiáng)，影響顯著。圖4c表明，在微波時(shí)間為9～11 min、料液比為 1∶18～1∶14（g/mL）時(shí)，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率可達(dá)到最大值。

表3 響應(yīng)曲面回歸模型方差分析

圖4 兩因素交互作用對(duì)木香提取物提取率影響的響應(yīng)曲面圖

2.2.3 最優(yōu)工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 利用Design-Expert軟件分析提取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的最優(yōu)條件為：微波功率402.76 W、提取時(shí)間 9.49 min、料液比 1∶16.41（g/mL），此時(shí)模型預(yù)測(cè)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率為2.12%?？紤]實(shí)際操作，將實(shí)驗(yàn)條件修改為微波功率403 W、微波時(shí)間 9.5 min、料液比為 1∶16.5（g/mL），并在此修正條件下進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取率的平均值為2.08%。

3 討論

在單因素試驗(yàn)中，木提取物的提取率隨著微波功率的增加先增大后減少，分析可能是過(guò)高微波功率會(huì)使分子運(yùn)動(dòng)加劇，導(dǎo)致木香中所有成分的溶出均增多（董發(fā)明和白喜婷，2008），從而使木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯所占比率下降；而提取率隨微波時(shí)間發(fā)生變化的原因可能上述相同。料液比對(duì)提取率的影響結(jié)果表明，提取率先是隨著料液比增加而提高，在超過(guò)1∶15后又有所下降，分析可能是甲醇體積的適當(dāng)增加可以使木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯更充分溶出，但當(dāng)甲醇過(guò)多時(shí)，一些醇溶性雜質(zhì)的溶出量也隨之增多 （朱珠和冷進(jìn)松，2010），因此提取率又下降。

本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)曲面法考察微波功率、提取時(shí)間和料液比對(duì)木香提取物提取率的影響。二次多元方程模型的回歸差異極顯著（P＜0.01）；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著；模型的校正確定系數(shù)R2大于0.95，說(shuō)明響應(yīng)值的98.62%來(lái)源于所選變量，以上結(jié)果說(shuō)明回歸方程擬合程度良好，可以很好地描述考察因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

在修正條件下分三次提取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，實(shí)際提取率為2.08%，與預(yù)測(cè)值僅差0.04%；三次提取率的RSD為1.272%，表明利用響應(yīng)曲面法得到的優(yōu)化結(jié)果具有實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)論

微波法提取木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的最佳工藝條件為：微波功率403 W、提取時(shí)間9.5 min、料液比 1∶16.5（g/mL）。在最佳工藝條件下的提取驗(yàn)證試驗(yàn)表明，木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率為2.08%。

[1]董發(fā)明，白喜婷.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取杜仲雄花中黃酮類(lèi)化合物的工藝參數(shù)[J].食品科學(xué)，2008，29（8）：227～231.

[2]范東斌，莫弦豐，陳玉竹等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化油茶餅粕蛋白的超聲輔助提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（3）：199～202.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典，一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.317.

[4]何力，張國(guó)文，楊佳，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取夏枯草中黃酮的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（9）：259～264.

[5]王萬(wàn)中.試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與分析[M].北京：高等教育出版社，2004.318～326.

[6]魏華，彭勇，馬國(guó)需，等.木香有效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2012，43（3）：613～620.

[7]張百霞，郭慶梅，王真真，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化金銀花總酚酸提取工藝[J].中成藥，2013，35（10）：2144～2148.

[8]朱珠，冷進(jìn)松.響應(yīng)面分析法優(yōu)化仙人掌黃酮提取工藝[J].食品科學(xué)，2010，31（22）：185～189.

[9]Li Q H.Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein[J].Food chemistry，2005，92（4）：701～706.