PTEN蛋白缺失與中國前列腺癌患者根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險關(guān)系的研究

王 濤，楊曉群，孫娟娟，甘華磊，王朝夫

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

PTEN蛋白缺失與中國前列腺癌患者根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險關(guān)系的研究

王 濤，楊曉群，孫娟娟，甘華磊，王朝夫

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：張力蛋白同源第10號染色體缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)缺失是西方國家前列腺癌中最常見的基因異常之一，與腫瘤的進展、預(yù)后均有一定相關(guān)性。鑒于前列腺癌的異質(zhì)性，不同地區(qū)、人群間其基因表達譜存在廣泛差異，本研究主要探討PTEN蛋白缺失在中國前列腺癌患者中的發(fā)生率以及與生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性。方法：選取2006—2011年225例局限性前列腺癌并采取根治切除術(shù)的患者為研究對象，回顧性收集所有患者的臨床病理資料，包括確診時年齡、血清前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)值、Gleason分級評分、TNM分期、手術(shù)切緣和術(shù)后生化復(fù)發(fā)與否及時間。將225例局限性前列腺癌根治切除標(biāo)本的腫瘤組織及癌旁組織制成組織芯片(tissue microarray，TMA)，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測PTEN蛋白在腫瘤及癌旁組織中的表達。采用χ2檢驗分析前列腺癌組織中PTEN蛋白缺失與患者臨床病理特征的相關(guān)性。運用Kaplan-Meier生存分析模型、Cox比例風(fēng)險模型分析PTEN蛋白缺失及患者臨床病理特征與生化復(fù)發(fā)的關(guān)系。結(jié)果：前列腺癌患者中PTEN蛋白缺失率為15%(33/217)，且存在PTEN蛋白缺失的前列腺癌患者其確診時血清PSA值(P=0.030)及年齡(P=0.009)要顯著高于PTEN表達的前列腺癌患者。單因素生存分析顯示，PTEN表達情況(P=0.013 1)、確診時血清PSA值(P=0.000 4)和Gleason分級評分(P=0.019 8)與前列腺癌患者的生化復(fù)發(fā)相關(guān)。Cox多因素分析結(jié)果表明，PTEN蛋白表達情況(HR=0.536，P=0.044)、確診時血清PSA值(HR=1.879，P=0.001)和Gleason分級評分(HR=1.361，P=0.030)為前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因素。結(jié)論：PTEN蛋白表達情況是局限性前列腺癌患者根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因素，檢測PTEN蛋白有望改善根治術(shù)后前列腺癌患者的管理及指導(dǎo)進一步治療。

前列腺腫瘤；張力蛋白同源第10號染色體缺失的磷酸酶基因；預(yù)后；生化復(fù)發(fā)；免疫組織化學(xué)

前列腺癌是發(fā)達國家中男性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率在不同的國家和地區(qū)存在顯著的差異［1-2］。雖然中國前列腺癌發(fā)病率較西方國家低，但其已成為中國男性泌尿生殖系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤，僅次于膀胱癌［1-3］。近年來的研究已證實張力蛋白同源第10號染色體缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)缺失是西方國家前列腺癌最常見的體細胞基因畸變之一，且在多項研究中證實與腫瘤進展及治療抵抗有關(guān)［4-7］。作為脂質(zhì)磷酸酶和PI3K/AKT/mTOR通路的負性調(diào)節(jié)因子，PTEN調(diào)控的蛋白與細胞生長、生存和基因穩(wěn)定性有關(guān)［8］。大多數(shù)情況下PTEN蛋白失活是通過10號染色體長臂2區(qū)3帶(10q23)上的基因缺失所致，該缺失能導(dǎo)致3,4,5三磷酸肌醇的累積，進而過度激活A(yù)KT，作用于包括BAD、GSK3、IkB激酶、mTOR以及FOXO家族等下游蛋白，致使其細胞代謝、分化、生存和細胞周期等調(diào)控作用的異常而出現(xiàn)細胞惡變，細胞的黏附、移動和侵襲能力增強［4,9］。

最近，一項針對中國前列腺癌患者的研究通過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)僅在7%的患者中存在PTEN缺失，而在西方國家前列腺癌中PTEN缺失率達到約40%［10］。因此，為進一步調(diào)查PTEN缺失在中國前列腺癌患者中的發(fā)生率及其預(yù)后意義，我們將225例中國局限性前列腺癌患者的根治標(biāo)本制成組織芯片(tissue microarray, TMA)，并用免疫組織化學(xué)方法(immunohistochemistry，IHC)檢測PTEN蛋白表達。由于前列腺癌存在高度異質(zhì)性，有多樣的生物學(xué)行為，目前臨床常用的指標(biāo)如Gleason評分不足以區(qū)分及準(zhǔn)確地指出每一個患者的臨床預(yù)后，該項研究有助于更好地理解中國與西方前列腺癌患者內(nèi)在的基因表達差異，并且為預(yù)測中國前列腺癌患者的生化復(fù)發(fā)提供可靠的預(yù)后因子。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2006—2011年間經(jīng)病理診斷確診為局限性前列腺癌的225例患者為研究對象。根治術(shù)前接受新輔助化療或放療的患者不納入本研究，組織學(xué)特點支持神經(jīng)內(nèi)分泌癌或小細胞癌的患者不納入本研究。通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者相關(guān)資料，且確診時的石蠟病理組織可以獲得。

患者確診時的平均年齡為71.9歲，中位年齡為73歲(52～87歲)；98.2%(221/225)的病例可獲得其術(shù)前血清前列腺特異性抗原(prostatespecific antigen，PSA)水平，其中PSA＞20 ng/mL 69例(31.2%)，PSA 10～20 ng/mL 83例(37.6%)，PSA＜10 ng/mL 69例(31.2%)［11］。Gleason評分≤6分40例(17.8%)，7分143例(63.6%)，≥8分42例(18.7%)。72.4%(163/225)的腫瘤局限于前列腺，13.8%(31/225)突破前列腺被膜，12.0%(27/225)侵犯精囊腺，4.0%(9/225)有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，22.7%(51/225)的患者手術(shù)切緣陽性。中位隨訪時間達到46.2個月(0.9～98.0個月)。生化復(fù)發(fā)定義為術(shù)后PSA水平超過0.2 ng/mL［12］。本研究人群的

主要臨床病理參數(shù)見表1。

1.2 構(gòu)建組織芯片

對225例患者的HE切片重新復(fù)核切片，找到典型的腫瘤區(qū)域，并在蠟塊相應(yīng)位置標(biāo)記作為癌組織的穿刺點；如果是多灶腫瘤，僅選取主要瘤體(最高Gleason評分或者最大直徑者)。用帶芯薄壁不銹鋼穿刺針(內(nèi)徑約0.6 mm)從供體組織蠟塊選定部位逐個取出組織芯片。每個病例均取癌組織及相應(yīng)癌旁正常腺體2次，共制成8張組織芯片，包含900個組織點，其中癌組織和相應(yīng)周圍正常腺體組織各有450個。

表 1 225例前列腺癌患者一般資料分析Tab. 1 Clinicopathologic features of the entire study cohort of 225 patients with prostate cancer

1.3 PTEN蛋白表達的檢測及判讀

采用免疫組織化學(xué)檢測PTEN蛋白表達。兔抗人PTEN單克隆抗體購自美國CST公司；一抗稀釋液購自丹麥Dako公司；二抗試劑盒購自中國基因科技(上海)有限公司。兔抗人PTEN單克隆抗體與一抗稀釋液按照1∶100比例稀釋。采用免疫組化染色EnVision法，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照。

采用H-score半定量法評價細胞核及細胞質(zhì)的染色強度［12］。每一病例計算其含癌組織點的平均H-score，并將患者分成H-score=0和H-score＞0兩組。H-score為0判讀為陰性，即PTEN蛋白缺失；H-score＞0判斷為陽性。血管內(nèi)皮細胞和基質(zhì)作為陽性內(nèi)對照。由2名泌尿系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域的病理科醫(yī)師按照上述評分標(biāo)準(zhǔn)行盲法判讀；其中8個病例因其癌旁正常腺體缺乏PTEN蛋白染色而不納入本研究分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)錄入及分析。利用χ2檢驗分析PTEN蛋白表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法分析PTEN蛋白表達及患者臨床病理特征包括確診時年齡、PSA值、Gleason評分、TNM分期、手術(shù)切緣與生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性，并用Log-rank法對結(jié)果進行顯著性檢驗。采用Cox比例風(fēng)險模型分析能獨立預(yù)測生化復(fù)發(fā)的指標(biāo)。以雙側(cè)檢驗P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)果

免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)果顯示，15%(33/217)的患者出現(xiàn)PTEN蛋白表達缺失(圖1)。分析PTEN蛋白缺失與臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在PSA＞20 ng/mL的病例中有26%(17/66)出現(xiàn)PTEN蛋白缺失，在PSA為10～20 ng/mL和 PSA＜10 ng/mL的病例中分別有13%(10/78)和10%(7/69)出現(xiàn)PTEN蛋白缺失(P=0.03)。另外，年齡≥73歲的前列腺癌患者，其PTEN蛋白缺失率要顯著高于年齡＜73歲的患者，分別為22%(23/106)和9%(10/111)(P=0.009)。本研究中PTEN蛋白缺失與病理分期(P=0.18)、Gleason評分(P=0.276)和手術(shù)切緣(P=0.148)均無顯著相關(guān)性。PTEN蛋白表達情況與臨床病理特征的關(guān)系見表2。

圖 1 PTEN蛋白在前列腺癌中的表達情況Fig. 1 Patterns of PTEN expression in prostate cancer

表 2 PTEN蛋白表達與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 2 Correlation of immunohistochemical PTEN expression with clinicopathological parameters at radical prostatectomy

2.2 單因素和多因素分析結(jié)果

采用Kaplan-Meier生存分析模型、Cox比例風(fēng)險模型分析PTEN蛋白表達情況及各臨床病理參數(shù)與前列腺癌生化復(fù)發(fā)的關(guān)系。在225例患者中共收集到175例患者的隨訪信息，中位隨訪時間46.2個月，33.7%(59/175)的患者在

隨訪時間內(nèi)出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)。單因素分析結(jié)果顯示，PTEN蛋白表達情況(P=0.013 1)、術(shù)前PSA水平(P=0.000 4)及Gleason分級評分(P=0.019 8)分別與生化復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，PTEN蛋白缺失、術(shù)前PSA水平高及Gleason分級評分高的患者有更短的生化復(fù)發(fā)時間；而年齡(P=0.442 1)、病理分期(P=0.180 6)、手術(shù)切緣(P=0.081 4)均與前列腺癌的生化復(fù)發(fā)無關(guān)。以血清PSA值、Gleason分級評分和PTEN表達為基礎(chǔ)的Kaplan-Meier生存曲線見圖2。多因素分析結(jié)果顯示，PTEN蛋白表達情況(HR=0.536，P=0.044)、血清PSA值(HR=1.879，P=0.001)和Gleason分級評分(HR=1.361，P=0.03)為前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因素(表3)。

圖 2 以術(shù)前PSA水平、Gleason評分和PTEN蛋白表達為基礎(chǔ)繪制的Kaplan-Meier曲線圖Fig. 2 Kaplan-Meier survival curves of patients based on preoperative PSA levels, Gleason scores and expression of PTEN in prostate cancer

表 3 PTEN蛋白表達及各臨床病理參數(shù)對于前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的預(yù)測價值Tab. 3 Predictive value of PTEN expression and clinico-pathological parameters for postoperative biochemical recurrence

3 討 論

本研究評價了PTEN蛋白在225例局限性前列腺癌根治術(shù)標(biāo)本中的表達情況及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并收集完善175例患者的隨訪資料，分析PTEN蛋白表達與生化復(fù)發(fā)的關(guān)系。本

研究發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白缺失發(fā)生在15%的前列腺癌患者中，且存在PTEN蛋白缺失的患者其生化復(fù)發(fā)風(fēng)險增大，PTEN蛋白缺失是預(yù)測前列腺癌生化復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因子。

先前已有研究報道PTEN蛋白與前列腺癌的關(guān)系。在西方國家，約40%的前列腺癌患者出現(xiàn)純合或雜合的PTEN蛋白缺失，顯著高于本研究前列腺癌患者的PTEN蛋白缺失率(15%)［13-14］。通過免疫組織化學(xué)技術(shù)或熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)，多項研究已證實PTEN蛋白表達減少或缺失與不良的生存預(yù)后有關(guān)［6,12］。對451例局限性前列腺癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)患者及451例未復(fù)發(fā)患者進行病例對照研究，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測分析這些患者PTEN表達情況，發(fā)現(xiàn)存在PTEN蛋白缺失的患者，根治術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險提高，且獨立于已知的臨床病理參數(shù)［12］。另有研究發(fā)現(xiàn)，存在PTEN蛋白缺失且發(fā)生轉(zhuǎn)移的去勢抵抗前列腺癌患者有更低的總體生存率，阿比特龍在這些患者中的有效作用時間更短［7］。目前，Gleason分級評分系統(tǒng)是評價前列腺癌患者生存預(yù)后的主要工具，Gleason評分越高，預(yù)后越差［15］。本研究同樣證實Gleason評分為前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后指標(biāo)，Gleason高評分(Gleason≥4+4)患者生化復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著升高；但是，鑒于前列腺癌本身為高度異質(zhì)性的疾病，Gleason分級評分系統(tǒng)存在一定的局限性，不同患者即使所得Gleason評分相同，臨床預(yù)后也會出現(xiàn)較大差異［16-17］；如本實驗Gleason評分3+4的患者組中有26%(16/61)出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)，在這部分患者中有25%(4/16)檢測出PTEN蛋白缺失，表明即使PTEN蛋白與Gleason評分不直接相關(guān)，仍可作為Gleason評分的輔助指標(biāo)協(xié)助判斷前列腺癌患者的預(yù)后。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白缺失與前列腺癌患者的年齡有關(guān)，年齡≥73歲的患者，其PTEN蛋白缺失率要顯著高于年齡＜73歲的患者，分別為22%(23/106)和9%(10/111) (P=0.009)。鑒于研究人群PTEN蛋白缺失率較低(15%)，不同年齡組中PTEN蛋白缺失相關(guān)的生化復(fù)發(fā)病例所占比例不大，因此，出現(xiàn)本研究中PTEN為生化復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測指標(biāo)，而年齡與生化復(fù)發(fā)無關(guān)的情況(P=0.442 1)；以往研究同樣證實年齡不是前列腺癌生化復(fù)發(fā)的有效預(yù)測指標(biāo)［12］。本研究納入患者其術(shù)后治療存在差異，針對高分級、高分期的患者會針對性的采取內(nèi)分泌治療；但是，本研究中傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)如PSA和Gleason評分均被證實能較好地預(yù)測生化復(fù)發(fā)，可以推斷整體上內(nèi)分泌治療對生化復(fù)發(fā)的影響有限，PTEN蛋白缺失預(yù)測生化復(fù)發(fā)具有一定參考價值。另有研究表明，PTEN蛋白缺失不是一個獨立的生化復(fù)發(fā)預(yù)測因子，除非聯(lián)合其他生物標(biāo)志物。如Heselmeyer-Haddad等［18］發(fā)現(xiàn)，在根治術(shù)后復(fù)發(fā)的前列腺癌患者中PTEN蛋白缺失率達到57%，PTEN、TBL1XR1和MYC探針聯(lián)合預(yù)測前列腺癌復(fù)發(fā)的靈敏度達到86%。此外，TMPRSS2:ERG基因融合已被證實在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，有不少研究探索了PTEN蛋白缺失與ERG重排間的關(guān)系以及他們的預(yù)后作用。Yoshimoto等［11］發(fā)現(xiàn)，單獨的PTEN蛋白缺失或TMPRSS2:ERG基因融合都不能很好地預(yù)測預(yù)后，但當(dāng)二者聯(lián)合后能夠預(yù)測早期生化復(fù)發(fā)。本研究結(jié)果顯示，PTEN蛋白缺失能獨立預(yù)測中國前列腺癌患者的生化復(fù)發(fā)，支持前者的觀點。

本研究使用免疫組織化學(xué)技術(shù)來檢測PTEN蛋白的表達情況。Mao等［10］利用單核苷酸多態(tài)性序列分析發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白失活發(fā)生在7%(3/39)的中國前列腺癌患者中，略低于本研究結(jié)果，推測原因一是不同研究所選樣本存在異質(zhì)性；二是PTEN蛋白表達失活可能通過多重機制，如microRNA表達及啟動子甲基化等，而不僅僅限于基因突變。此外，先前的研究已證實在前列腺癌組織中FISH檢測PTEN蛋白缺失同免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測PTEN蛋白表達之間存在較高的一致性。FISH檢測出的PTEN蛋白缺失中80%能被免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測出來；同樣通過高分辨率單核苷酸序列分析檢測出的PTEN蛋白缺失中超過80%能被免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測出來［5］。其他兩項研究也發(fā)現(xiàn)FISH檢測出的PTEN蛋白缺失中有52%或66%能通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測出PTEN蛋白缺失［14,19］。值得注意的是，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測出PTEN蛋白缺失的病例中有45%或37%不能通過FISH檢測出

相應(yīng)基因缺失，同樣表明除了基因缺失，存在其他機制導(dǎo)致PTEN蛋白缺失，可能包括突變、microRNA表達和啟動子甲基化等［5,14,19-20］。因此，F(xiàn)ISH可能客觀上會低估前列腺癌中PTEN蛋白的缺失率。免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測評估PTEN蛋白表達的優(yōu)勢在于可以檢測出除基因異常改變以外的機制導(dǎo)致的PTEN蛋白缺失［5,21］。臨床應(yīng)用上，在常規(guī)福爾馬林固定石蠟包埋的病理標(biāo)本上應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測PTEN蛋白表達情況是一種比較有效的指導(dǎo)前列腺癌預(yù)后的檢測手段。

綜上所述，本研究證實PTEN蛋白缺失在中國前列腺癌患者的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，是一種有效的預(yù)后指標(biāo)，有助于指導(dǎo)前列腺癌患者的臨床處理。該研究的結(jié)論仍需要大樣本的實驗進一步證實。隨著以PI3K信號通路多個成分為靶點的治療手段逐步開展，穩(wěn)定檢測PTEN蛋白的表達情況有望在臨床前列腺癌管理中發(fā)揮重要作用。

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PTEN protein loss is associated with an increased risk of recurrence in Chinese patients after prostatectomy for clinically localized prostate canc er

WANG Tao, YANG Xiaoqun, SUN Juanjuan,

GAN Hualei, WANG Chaofu (Department of Pathology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

WANG Chaofu E-mail: wangchaofu@126.com

Background and purpose: Loss of the tumor suppressor phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN) is one of the most common somatic genetic aberrations in prostate cancer in Western countries and is frequently associated with tumor progression and poor prognosis. This study aimed to investigate the frequency of PTEN protein loss in Chinese prostate cancer patients and to determine its association with the biochemical recurrence of prostate cancer. Methods: The data from 225 diagnosed localized prostate cancer patients with radical prostatectomy from 2006 to 2011 were collected retrospectively, including patient’s age at diagnosis, prostate-specific antigen (PSA) level at diagnosis, Gleason score, clinical stage, surgical margin, and time to biochemical recurrence or not. This study performed PTEN protein immunohistochemistry on tissue microarrays, which were made from 225 Chinese prostate cancer patients mentioned above, treated by radical prostatectomy with one

Prostate cancer; Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10; Prognosis; Biochemical recurrence; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.08.006

R737.25

A

1007-3639(2015)08-0595-07

2015-03-01

2015-05-28）

王朝夫 E-mail：wangchaofu@126.com

case including 2 cancer spots and 2 adjacent normal gland spots. Correlations of PTEN loss with clinicopathological features were analyzed using χ2test. Kaplan-Meier survival model and Cox proportional hazards regression model were used to evaluate the predictive role of PTEN protein expression and patient characteristics for biochemical recurrence. Results: PTEN protein loss was observed in 15% of the patients and was associated with increased preoperative PSA levels (P=0.03) and old age (P=0.009). In univariate Kaplan–Meier analysis, the factors associated with the biochemical recurrence of prostate cancer included PSA levels (P=0.000 4), Gleason sum (P=0.019 8), and PTEN status (P=0.013 1). In multivariable Cox regression analysis, PTEN expression (HR=0.536, P=0.044), PSA levels (HR=1.879, P=0.001), and Gleason score (HR=1.361, P=0.03) were significant in predicting biochemical recurrence of prostate cancer. Conclusion: PTEN protein loss is associated with an increased risk of recurrence, independent of known clinicopathological factors.