miR-216a-5p通過下調(diào)MMP16表達抑制肺癌細胞的侵襲

安 寧，李宏敏，于瑞蓮，羅樹春，張 明，蘭海濤

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610072

miR-216a-5p通過下調(diào)MMP16表達抑制肺癌細胞的侵襲

安 寧，李宏敏，于瑞蓮，羅樹春，張 明，蘭海濤

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610072

背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類存在于真核生物體內(nèi)只有19～39 bp大小的內(nèi)源性非編碼RNA，它能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控基因的表達，在細胞的增殖分化、新陳代謝、免疫調(diào)控和凋亡等方面起著重要的作用。本研究檢測miR-216a-5p在肺癌組織和肺癌細胞系的表達并探討其對肺癌細胞侵襲能力的影響及其調(diào)控機制。方法：使用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測55例肺癌患者的肺癌組織和7種肺癌細胞系中miR-216a-5p的表達情況；miR-216a-5p瞬時轉(zhuǎn)染A549、95D和H460 3種肺癌細胞系，使用Transwell侵襲實驗檢測miR-216a-5p對肺癌細胞系侵襲能力的影響；預(yù)測并構(gòu)建miR-216a-5p的候選靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶16(matrix metalloproteinase 16，MMP16)基因的雙熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒，使用qRT-PCR和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測miR-216a-5p對靶基因MMP16的mRNA和蛋白表達的影響；小干擾RNA(siRNA)干擾MMP16與上調(diào)miR-216a-5p對比檢測其對肺癌細胞侵襲能力的影響。結(jié)果：90.91%(50/55)的肺癌患者腫瘤組織中miR-216a-5p表達明顯低于對應(yīng)的癌旁組織(P＜0.05)。7種肺癌細胞系中miR-216a-5p的表達量僅為對照組的7.00%～32.00%(P＜0.05)。上調(diào)miR-216a-5p的表達能夠抑制肺癌細胞的侵襲；siRNA干擾MMP16與轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-216a-5p都能夠抑制肺癌細胞中MMP16的表達，并抑制肺癌細胞侵襲。結(jié)論：miR-216a-5p可以作為臨床肺癌診斷的候選標志物之一，并且其能夠通過下調(diào)MMP16的表達從而抑制肺癌細胞的侵襲。

肺癌；miR-216a-5p；基質(zhì)金屬蛋白酶16；侵襲

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，長度為19～25個核苷酸，由高等真核生物基因組編碼［1］。同一miRNA可以調(diào)控多個不同的mRNA分子，不同的miRNA分子也可以協(xié)同調(diào)控同一mRNA分子。根據(jù)預(yù)測，人類細胞中約1/3的蛋白編碼基因受miRNA的調(diào)控，在細胞的增殖、凋亡、分化、代謝、個體發(fā)育和病毒感染等方面都發(fā)揮著重要的作用［2-3］。近年來，大量研究結(jié)果顯示，失調(diào)的miRNA與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系，可能發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用［4-6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。研究結(jié)果表明，miR-216a通過作用JAK2基因抑制胰腺癌細胞生長和促進凋亡［7］，并通過靶向調(diào)控蛋白激酶Cα抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲［8］。肺癌作為威脅人類生命的主要疾病之一，近年來多項研究顯示，多種miRNA對其發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。Yanaihara等［9］對104對肺癌組織和癌旁組織的基因芯片分析顯示miR-216a也有表達下調(diào)?；|(zhì)金屬蛋白酶16(matrix metalloproteinase 16，MMP16)作為能降解細胞外基質(zhì)的酶類，與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，如膀胱癌［10］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［11］。本研究旨在探討miR-216a-5p在肺癌組織和細胞系中的表達情況，靶向調(diào)節(jié)MMP16的功能，及其抑制肺癌細胞侵襲的能力。

1 材料和方法

1.1 組織細胞系及主要實驗試劑

組織標本取自四川省人民醫(yī)院2014年1月—2014年5月手術(shù)治療的肺癌患者55例。其中男性35例，女性20例；年齡35～81歲。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。每例取癌組織作為實驗組，取距離相應(yīng)癌組織2 cm以上的癌旁組織作為對照組，液氮保存。人肺癌細胞系A(chǔ)549、95D、95C、H460、H446、H1299、H358及正常人支氣管上皮細胞系HBE由本實驗室保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、Optim-MEM、TRIzol、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。pmiRGLO雙熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒和pmiRGLO雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自美國Promega公司。SqRT-PCR檢測試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。內(nèi)參U6的反轉(zhuǎn)錄引物為：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAA TATGGAAC-3’；miR-216a-5p的反轉(zhuǎn)錄引物為：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGAGGGATTCTCACAG-3’；內(nèi)參U6的擴增引物分別為：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’和5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3’；miR-21 6a-5p的擴 增引 物 分別 為 ：5’-TAATCTCAGCTGGCAACT-3’和5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3’；miR-216a-5p mimics及對照scramble分別為：5’-UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA-3’及5’-GGACGGCGAUCAGAUAAGAGUU-3’，MMP16的干擾RNA序列(si-MMP16)為：5’-AUAAUCUCCAAUAUCCUCUU AAA-3’。以上引物和RNA序列均購自廣州銳博生物科技有限公司。MMP16擴增引物為：5’-AGCACGTTGTTTCCCTTCC-3’及5’-CCCGAGCTGTTTATCCATCA-3’；β-actin擴增引物為：5’-CTTAGTT GCGTTACACCCTTTCTTG-3’及5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，由美國Invitrogen公司合成。PVDF膜和Millicell小室

購自德國Merck Millipore公司。兔抗人MMP16 Ⅰ抗(1∶100)購自英國Abcam公司，Anti-β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 組織及細胞系總RNA的提取

常規(guī)方法培養(yǎng)細胞，待細胞生長至培養(yǎng)瓶壁80%～90%(約3×106個)時，棄去培養(yǎng)基，加PBS洗滌細胞3次，加入1 mL TRIzol，左右晃動，裂解細胞，待充分勻漿后轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，室溫靜置5 min。從液氮中取出組織，放入預(yù)冷的研缽中進行研磨，期間不斷地加入液氮保持低溫直至研磨成粉末。取0.5 g組織粉到EP管中，加入1 mL TRIzol混勻，在室溫(15～30 ℃)下溫育15 min。

在上述細胞或組織裂解液的EP管中，按照1∶5的比例加入相應(yīng)體積的氯仿(200 μL)，蓋上EP管蓋子，在漩渦儀上振蕩15 s，在室溫(15～30 ℃)溫育5 min后，1 000×g(4 ℃)離心15 min。取上層水置于新EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后在室溫(15～30 ℃)溫育10 min，1 000×g(4 ℃)離心10 min。棄上清液，加入預(yù)冷75%(DEPC)乙醇1 mL，渦旋混合，1 000×g (4 ℃)離心5 min，棄上清液，保留沉淀。加入適量無RNA酶的DEPC水溶解總RNA。用RNase-free water溶解RNA沉淀。電泳檢測RNA質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳觀察5 S、18 S及28 S條帶，紫外分光光度計檢測260 nm/280 nm吸光度(D)比值，計算RNA濃度。放置-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測組織及細胞系中miR-216a-5p的表達

按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑［購自寶生物工程(大連)有限公司］說明書對于組織和各細胞系所提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR引物(RiboBio)按說明書進行稀釋。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL：反轉(zhuǎn)錄頸環(huán)引物4 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，反轉(zhuǎn)錄混合引物1.6 μL，提取的總RNA模板1 μg，無RNA酶水至20 μL。以上體系混勻后，瞬時離心試劑。在qRT-PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 15 s。qRT-PCR選用20 μL反應(yīng)體系在Bio-Rad CFX96 qRT-PCR反應(yīng)儀上進行。miR-216a-5p和U6的qRT-PCR引物(RiboBio)按說明書進行稀釋，程序為：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性10 s，55 ℃延伸20 s，70 ℃退火20 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認qRT-PCR的擴增曲線和融解曲線，進行qRT-PCR定量時制作標準曲線等。相對miRNA表達采用Ct值精確計算，將U6 snRNA作為內(nèi)參。

1.4 熒光素酶活性檢測miR-216a-5p對MMP16調(diào)控的靶位點

運用TargetScan軟件對miR-216a-5p潛在的靶基因進行預(yù)測，篩選出MMP16的一個非保守位點的3’UTR端5’-UUUAAGAGGAUAUUGGAGAUUAU-3’可能是miR-216a-5p的靶向位點。真核表達載體質(zhì)粒pmiRGLO靶基因報告質(zhì)粒及3’-UTR端突變報告載體均由廣州市銳博生物科技有限公司構(gòu)建。野生型MMP16 3’UTR-熒光素酶載體，命名為MMP16-Wt。突變型PRKCA 3’UTR-熒光素酶報告載體，命名為MMP16-Mut。將熒光素酶報告載體與miR-216a-5p mimics及對照scramble序列按LipofectamineTM2000說明書，根據(jù)實驗分組情況對各組進行共轉(zhuǎn)染A549細胞。轉(zhuǎn)染4 h后換液，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收獲細胞。按Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，使用檢測儀檢測細胞熒光素酶活性。計算相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.5 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測miR-216a-5p對MMP16蛋白表達的影響

將miR-216a-5p mimics或scramble轉(zhuǎn)染A549細胞，48 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按各樣品100 μg等量樣本，進行SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉液，搖床上室溫封閉1 h；用TBST適當(dāng)稀釋加入MMP16抗體或β-actin抗體，4 ℃過夜。次日用TBST室溫洗膜2次，每次10 min，最后用TBS洗膜10 min；同樣方法稀釋二抗，室溫溫育1～2 h，并再次用TBST及TBS洗膜；配制顯影液，并用錫箔紙包住使其避光，將顯影液均勻滴加至膜上，曝光顯影并采圖。β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參，用于比對MMP16蛋白表達情況。

1.6 qRT-PCR檢測MMP16 mRNA表達

將miR-216a-5p mimics或scramble轉(zhuǎn)染A549細胞，24 h后提取各組細胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄cDNA按照試劑MMLV說明書操作。反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 15 s。將MMP16和β-actin引物使用雙蒸水稀釋到100 μL，按照寶生物工程(大連)有限公司SYBR Premix(Perfect Real Time)試劑盒說明書配置PCR體系20 μL。使用兩步法進行qRT-PCR擴增，預(yù)變性1個循環(huán)：95 ℃ 20 s；qRT-PCR反應(yīng)40個循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。反應(yīng)結(jié)束后，以β-actin作為內(nèi)參，相對MMP16表達采用Ct值精確計算，得出各組細胞的MMP16 mRNA表達量。

1.7 Transwell細胞侵襲實驗

將50 mg/L基質(zhì)膠置于4 ℃融化，并用無血清培養(yǎng)基將其1∶5.5稀釋混勻，50 μL/孔加至Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上，注意整個操作在冰上及無菌條件下進行，所有器皿及試管均事先預(yù)冷。37 ℃下溫育60 min，此時Matrigel已經(jīng)形成膠。吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入100 μL含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)液，37 ℃30 min。讓細胞撤血清饑餓12～24 h，消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)液或含1%血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度至105個/mL。吸取細胞懸液400 μL接種于Transwell上室內(nèi)，下室內(nèi)加入含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL。在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的溫育箱中培養(yǎng)24 h。棄去上室中的培養(yǎng)液，并用沾有0.9%氯化鈉溶液的棉簽輕輕擦去濾膜上層細胞。濾膜下層細胞以甲醇固定，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下選擇膜10個不重疊的視野觀察穿過膜的細胞數(shù)，計算細胞侵襲率。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果均以表示。兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織和各肺癌細胞系中miR-216a-5p的表達情況

采用qRT-PCR對55例肺癌患者腫瘤組織及對應(yīng)癌旁組織中miR-216a-5p的表達情況進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在90.91%(50/55)的肺癌患者腫瘤組織中表達明顯低于對應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1A)，其余9.09%(5/55)的肺癌患者肺癌組織miR-216a-5p的表達與對應(yīng)癌旁組織相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。同樣的方法檢測A549、H460、H446、95C、95D、H1299及H358幾種肺癌細胞系中miR-216a-5p表達，與正常人支氣管上皮細胞系HBE相比也處于明顯的低表達。其中A549中下調(diào)最為明顯，僅為HBE表達量的7.00%，表達量最高的H1299也只達到HBE表達量的32.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1B)。

圖 1 qRT-PCR檢測55例肺癌和7種肺癌細胞系中miR-216a-5p的表達情況Fig. 1 The expressions of miR-216a-5p in 55 cases of lung cancer and 7 lung cancer cell lines detected by qRT-PCR

2.2 miR-216a-5p對MMP16 mRNA 3’UTR熒光酶活性的影響

為了驗證軟件預(yù)測的MMP16是否為miR-216a-5p的目標靶基因，能否和MMP16的3’UTR端結(jié)合，將miR-216a-5p mimics或scramble與構(gòu)建并驗證過的MMP16-Wt、MMP16-Mut共轉(zhuǎn)染到A549細胞中，在48 h后檢測雙熒光酶活性。結(jié)果顯示：miR-216a-5p mimics明顯抑制野生型MMP16-Wt報告載體的熒光素酶活性，與scramble相比下調(diào)58%(P＜0.05)；而miR-216a-5p mimics對突變型MMP16-Mut載體的熒光素酶活性無明顯抑制作用(圖2)。實驗結(jié)果表明，與軟件預(yù)測結(jié)果一致，miR-216a-5p能和MMP16的3’UTR端結(jié)合。

圖 2 miR-216a-5p作用MMP16 3’UTR抑制熒光酶活性Fig. 2 miR-216a-5p inhibited the luciferase activity of MMP16 mRNA

2.3 miR-216a-5p對MMP16 mRNA和蛋白水平的影響

由于miRNA作用于靶基因既可能影響其mRNA又可能影響蛋白水平的表達，為了研究miR-216a-5p到底如何作用MMP16，首先，我們使用qRT-PCR檢測了A549細胞轉(zhuǎn)染miR-216a-5p mimics、si-MMP16或scramble后MMP16的mRNA表達水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-216a-5p mimics組的A549細胞MMP16的mRNA表達水平明顯下降，下調(diào)約84%，與轉(zhuǎn)染干擾RNA組si-MMP16下調(diào)效果一致(P＜0.05，圖3A)，說明MMP16轉(zhuǎn)錄過程受到抑制或者mRNA被剪切降解；然后，采用Western blot檢測了轉(zhuǎn)染miR-216a-5p mimics后MMP16蛋白水平的變化，轉(zhuǎn)染miR-216a-5p mimics組和si-MMP16干擾RNA組，明顯抑制MMP16蛋白的表達(P＜0.05，圖3B)。以上數(shù)據(jù)說明，miR-216a-5p能夠靶向MMP16并抑制其蛋白的表達。

圖 3 miR-216a-5p抑制MMP16的mRNA和蛋白表達Fig. 3 The miR-216a-5p inhibited the MMP16 expressions at mRNA and protein levels

2.4 miR-216a-5p能抑制肺癌細胞的侵襲能力

miR-216a-5p mimics、si-MMP16或scramble瞬時轉(zhuǎn)染A549、95D和H460細胞，scramble為陰性對照。采用Transwell侵襲實驗檢測miR-216a-5p對于肺癌侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，在3種肺癌細胞系中，miR-216a-5p均能顯著抑制其侵襲能力，其中A549細胞抑制率為62%，95D細胞抑制率為80%，H460細胞抑制率為76%。干擾RNA組si-MMP16能夠起到與miR-216a-5p相同的抑制效果(P＜0.05，圖4)。結(jié)果說明，miR-216a-5p與si-MMP16能夠產(chǎn)生相同的效果，均能抑制肺癌細胞的侵襲能力，表明miR-216a-5p通過下調(diào)MMP16的表達從而抑制肺癌細胞的侵襲。

圖 4 miR-216a-5p通過作用MMP16抑制肺癌細胞的侵襲能力Fig. 4 miR-216a-5p inhibited the invasion ability of lung cancer cells through action on MMP16

3 討 論

肺癌在世界范圍內(nèi)是死亡率最高的腫瘤，它嚴重威脅著人類的健康。在過去的十年里全世界有上百萬人死于肺癌［12］。雖然肺癌發(fā)生的蛋白和基因組圖譜已經(jīng)部分闡明，但位居死亡率之首的肺癌5年存活率仍無明顯改善(僅15%～20%)，缺乏有效的早期診斷和治療手段是兩大主要原因［13］。因此，研究肺癌發(fā)生、發(fā)展的機制并尋求其基因治療的靶位點具有非常重要的意義。miRNA是一類存在于真核生物體內(nèi)只有19～39 bp大小的內(nèi)源性非編碼RNA，它能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制基因的表達［1］。大量研究表明，miRNA在腫瘤中可能起著癌基因和抑癌基因的作用［14］。Yanaihara等［7］在基因芯片分析時發(fā)現(xiàn)，miR-216a在肺癌組織中處于表達下調(diào)。在胰腺癌中，miR-216a能夠調(diào)控JAK2基因抑制胰腺癌細胞生長和促進凋亡［7］。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-216a能作為臨床診斷的標志物，對結(jié)直腸癌進行早期診斷預(yù)測［15］。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的主要原因。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移分為黏附、降解和遷移三個步驟。腫瘤進行轉(zhuǎn)移，必須先進入血管，在血液中存活，遷移出血管，侵襲外周組織并生長［16］。而MMP16在腫瘤發(fā)生的早期介導(dǎo)了細胞外基質(zhì)及基底膜的降解，為促進腫瘤的增殖創(chuàng)造微環(huán)境。Chen等［10］研究發(fā)現(xiàn)，MMP16在膀胱癌細胞的遷移過程中發(fā)揮著重要作用，并且能夠被miR-200b所調(diào)控。還有研究結(jié)果表明，MMP16受miR-146b-5p調(diào)控影響著神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、遷移能力［11］。

在本研究中，我們首次對于miR-216a-5p在肺癌組織和肺癌細胞系中的表達情況進行了定量檢測。在55例肺癌患者中，90.91%的肺癌患者腫瘤組織中miR-216a-5p表達明顯低于對應(yīng)的癌旁組織，腺癌和鱗癌中這種下調(diào)表達趨勢沒有明顯差別且與腫瘤分期無關(guān)。在7種肺癌細胞系中，miR-216a-5p同樣表達下調(diào)。檢測表明，miR-216a-5p無論在肺癌組織中還是在肺癌細胞系中都是處于異常下調(diào)表達的水平，這種異常下調(diào)表達在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能會起到某些特殊作用。本研究通過軟件預(yù)測、雙熒光素酶報告基因表達檢測、qRT-PCR和Western blot檢測顯示，miR-216a-5p能夠靶向MMP16并抑制其蛋白的表達，證實了miR-216a-5p對于MMP16的作用機制。MMP16對于細胞的跨膜侵襲具有重

要作用［17］。此外，本研究探討了miR-216a-5p對于肺癌細胞侵襲的影響，在A549、95F和H460 3種細胞中，miR-216a-5p起到的作用與si-MMP16一致，能夠顯著地抑制細胞的侵襲。

綜上所述，miR-216a-5p在調(diào)控肺癌細胞的侵襲方面發(fā)揮重要作用，其作用機制為下調(diào)抑制MMP16蛋白的表達，從而抑制肺癌細胞的侵襲能力，為肺癌臨床基因治療提供新的靶點。由于其在肺癌中的異常表達，將為肺癌的臨床早期預(yù)測和診斷提供新的標志物。

［1］ BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function［J］. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

［2］ LEWIS B P, BURGE C B, BARTEL D P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets ［J］. Cell, 2005, 120(1): 15-20.

［3］ CALIN G A, CROCE C M. MicroRNA signatures in human cancers［J］. Nat Rev Cancer, 2006, 6(11): 857-866.

［4］ CALIN G A, SEVIGNANI C, DUMITRU C D, et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(9): 2999-23004.

［5］ VOORHOEVE P M, LE SAGE C, SCHRIER M, et al. A genetic screen implicates miRNA-372 and miRNA-373 as oncogenes in testicular germ cell tumors［J］. Cell, 2006, 124(6): 1169-1181.

［6］ JOHNSON S M, GROSSHANS H, SHINGARA J, et al. RAS is regulated by the let-7 microRNA family［J］. Cell, 2005, 120(5): 635-647.

［7］ WANG S, CHEN X, TANG M. MicroRNA-216a inhibits pancreatic cancer by directly targeting Janus kinase 2［J］. Oncol Rep, 2014, 32(6): 2824-2830.

［8］ 趙文健, 楊 亮, 唐偉軍. miR-216a通過靶向調(diào)控蛋白激酶Cα抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲［J］. 中國癌癥雜志, 2013, 23(6): 420-424.

［9］ YANAIHARA N, CAPLEN N, BOWMAN E, et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis ［J］. Cancer Cell, 2006, 9(1): 189-198.

［10］ CHEN M F, ZENG F, QI L, et al. Transforming growth factor beta 1 induces epithelial mesenchymal transition and increased expression of matrix metalloproteinase16 via miR-200b downregulation in bladder cancer cells［J］. Mol Med Rep, 2014, 10(3): 1549-1554.

［11］ LI Y, WANG Y, YU L, et al. miR-146b-5p inhibits glioma migration and invasion by targeting MMP16［J］. Cancer Lett, 2013, 339(2): 260-269.

［12］ GREENLEE R T, MURRAY T, BOLDEN S, et al. Cancer statistics, 2000［J］. CA Cancer J Clin, 2000, 50(5): 7-33.

［13］ MEYERSON M, CARBONE D. Genomic and proteomic profiling of lung cancers: lung cancer classification in the age of targeted therapy［J］. J Clin Oncol, 2005, 23(32): 19-26.

［14］ CHEN C Z. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］. N Engl J Med, 2005, 35(17): 68-71.

［15］ ZHANG J, ZHANG K, BI M, et al. Circulating microRNA expressions in colorectal cancer as predictors of response to chemotherapy［J］. Anticancer Drugs, 2014, 25(3): 346-352.［16］ LIOTTA L A, STRACKE M L, KOHN E, et a.Tumor invasion and metastases: biochemical mechanisms［J］. Prog Clin Biol Res, 1989, 256(9): 381-398.

［17］ SATO H, TANAKA M, TAKINO T, et al. Assignment of the human genes for membrane-type-1, -2, and -3 matrix metalloproteinases (MMP14, MMP15, and MMP16) to 14q12.2, 16q12.2-q21, and 8q21, respectively, by in situ hybridization ［J］. Genomics, 1997, 39(3): 412-413.

miR-216a-5p inhibits invasion ability in human lung cancer cells by down-regulation of MMP16

expression

AN Ning, LI Hongmin, YU Ruilian, LUO Shuchun, ZHANG Ming, LAN Haitao (Department of Oncology, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu Sichuan 610072, China)

AN Ning E-mail: anning_scph@163.com

Background and purpose: MicroRNA (miRNA) belongs to a class of 19 to 30 nucleotidelong, endogenous noncoding RNA expressed in eukaryotes and predominantly inhibits gene expression at the posttranscriptional level. The miRNAs play critical roles in cell proliferation and differentiation, apoptosis, metabolism, and immune regulation. This study aimed to detect the expression of miR-216a-5p in lung cancer tissues and lung cancer cell lines, and to discuss the effects of miR-216a-5p on the invasion ability of lung cancer cells and the mechanism. Methods: Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of miR-216a-5p in lung cancer tissues of 55 cases and 7 lung cancer cell lines. Three lung cancer cell lines of A549, 95D and H460 were transiently transfected by miR-216a-5p, and Transwell was used to detect the effects of miR-216a-5p on the invasion of lung cancer cell lines. The dual luciferase reporter plasmids containing the miR-216a-5p candidate target gene and the gene of matrix metalloproteinase 16 (MMP16) were predicted and constructed. qRT-PCR and Western blot were used to detect the changes in mRNA and protein levels of target gene MMP16 by miR-216a-5p. The interference of MMP16 by siRNA and up-regulation miR-216a-5p by transfection were compared on the invasion of lung cancer cells. Results: The miR-216a-5p expression levels were all significantly reduced in 90.91% (50 of 55 patients) tumor tissues compared

Lung cancer; miR-216a-5p; Matrix metalloproteinase 16; Invasion

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.08.005

R734.2

A

1007-3639(2015)08-0588-07

2014-12-14

2015-04-10）

安寧 E-mail：anning_scph@163.com

with corresponding adjacent normal lung tissues (P＜0.05). The miR-216a-5p expression levels were only 7.00%-32.00% in 7 lung cancer cells compared with the control group (P＜0.05). Up-regulation of the expression of miR-216a-5p inhibited the invasion of lung cancer cells; interference of MMP16 by siRNA, as well as up-regulating miR-216a-5p by transfection, inhibited the expression of MMP16 in lung cancer leading to inhibition of the invasion of lung cancer cells. Conclusion: miR-216a-5p can be a candidate marker in clinical diagnosis and it can inhibit the invasion of lung cancer cells by down-regulating the expression of MMP16.