白藜蘆醇誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡

楊 珺，張俊強(qiáng)，趙 歡，安 梅，孫和炎，陳曉宇

白藜蘆醇誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡

楊 珺1，2，張俊強(qiáng)1，趙 歡1，安 梅3，孫和炎4，陳曉宇1

目的探討白藜蘆醇對佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠滑膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法0.1 ml弗氏完全佐劑注射SD大鼠左后足跖皮內(nèi)復(fù)制AA模型，28 d后，采用組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，CCK-8法檢測白藜蘆醇對滑膜細(xì)胞增殖的影響；Hoechst 33258熒光染色、瓊脂糖凝膠電泳觀察滑膜細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果CCK-8法表明白藜蘆醇可以抑制滑膜細(xì)胞增殖，并且呈劑量依賴性趨勢；高濃度白藜蘆醇（20、50 μmol／L）能誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，Hoechst 33258染色觀察到細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡小體，電泳呈現(xiàn)出階梯狀條帶。結(jié)論白藜蘆醇可能會通過抑制AA大鼠滑膜細(xì)胞的增生，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡而達(dá)到治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

白藜蘆醇；佐劑性關(guān)節(jié)炎；滑膜細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；大鼠

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性自身免疫性疾?。?］。其病理特征主要表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增生，引起軟骨及骨的破壞，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)強(qiáng)直及功能障礙。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）是目前研究RA的主要動物模型之一。白藜蘆醇是一種主要存在于虎杖、葡萄等植物中的天然活性多酚化合物，其抗增殖和調(diào)節(jié)免疫的功效為RA等疾病的治療提供了新的思路［2］。目前研究［3］認(rèn)為，RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織增生，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞原位增殖過剩，且滑膜細(xì)胞凋亡障礙。為進(jìn)一步揭示白藜蘆醇對RA患者治療的可能機(jī)制，該研究以AA大鼠的踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜為實(shí)驗(yàn)樣本，采用組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，從細(xì)胞凋亡的角度觀察白藜蘆醇對AA大鼠的踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，旨在探討白藜蘆醇對AA大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 IX70-SIF2型倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；全自動多功能型酶標(biāo)儀購于美國BIO-RAD公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購于美國Gibco公司；白藜蘆醇購于美國Sigma公司，純度≥99.9%；兔抗鼠血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhension molecule-1，VCAM-1）、Hoechst 33258、CCK-8購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 AA模型大鼠建模 普通級SD雄性大鼠20只，180～200 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，大鼠左后足趾皮內(nèi)注射0.1 ml弗氏完全佐劑（卡介苗80℃滅活1 h，與高壓滅菌的液體石蠟充分碾磨混勻，配成10 g／L乳劑）致炎。

1.2.2 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 24 d后，AA模型大鼠建模成功，處死大鼠，參照先前實(shí)驗(yàn)方法［4］，AA模型大鼠置0.1%新潔爾滅液中15 min浸泡消毒，于AA大鼠非致炎側(cè)（即右側(cè)）踝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，小心分離肌肉，見肌肉下光亮平滑的滑膜組織；手術(shù)刀背鈍性分離關(guān)節(jié)囊的纖維層和滑膜層，取出滑膜層組織（每只大鼠雙側(cè)共約10 mg），剔除周圍脂肪、纖維組織等，將其剪為1～2 mm2大小，無Ca2＋、Mg2＋D-Hank液輕輕漂洗3次。將小塊滑膜組織均勻排列在培養(yǎng)瓶的底壁，置飽和濕度條件下37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)2 h。然后加入少許37℃預(yù)溫的20%小牛血清DMEM培養(yǎng)液，再置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2 d更換培養(yǎng)基（含20%小牛血清DMEM）1次，待組織塊周邊長出較多成纖維樣滑膜細(xì)胞后，棄除組織塊，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)（20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），待細(xì)胞長滿后，1 ml 0.25%37℃胰蛋白酶消化細(xì)胞2～3 min，待80%～90%細(xì)胞由梭形收縮成圓形，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，培養(yǎng)3～4 d后再傳代培養(yǎng)；選擇生長旺盛、形態(tài)良好、致密單層的細(xì)胞，消化后凍存于含20%血清、10%DMSO的培養(yǎng)液中，再置于－80℃保存或轉(zhuǎn)至液氮中貯存。實(shí)驗(yàn)中用傳代3～5次滑膜細(xì)胞。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定滑膜細(xì)胞：6孔板底部放置清潔蓋玻片，95%的冷乙醇溶液固定滑膜細(xì)胞30 min；加入一抗（兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗體，1∶500），37℃孵育30 min，PBS反復(fù)洗3次；加入二抗（羊抗兔Ig-G-FITC），37℃孵育30 min，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 CCK-8法測定白藜蘆醇對滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響 將傳代（3～5代）的滑膜細(xì)胞以5× 105個／L的密度接種于24孔培養(yǎng)板中。37℃培養(yǎng)48 h，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度的白藜蘆醇溶液（0、1、5、20、50 μmol／L）100 μl，每組設(shè)4個平行孔，培育48 h。反應(yīng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)基，加入不含藥物的培養(yǎng)基后，每孔加入20 μl的CCK-8溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取出培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀（Elx800，美國BioTek公司）450 nm檢測吸光度值（absorbence，A），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Hoechst 33258熒光染色 消化對數(shù)生長期的成纖維樣滑膜細(xì)胞，將濃度為5×106個／L細(xì)胞接種于6孔板中，板中放入包被了多聚賴氨酸的蓋玻片。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換培養(yǎng)液，并加入白藜蘆醇（終濃度分別為0、5、20、50μmol／L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，甲醇∶冰醋酸＝3∶1在4℃固定10 min，PBS漂洗3次，每次10 min；1%Triton X-100透化10 min，加入Hoechst 33258（終濃度5 mg／L）避光染色10 min，PBS漂洗3次，每次10 min，封片，熒光顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳 按試劑盒說明書進(jìn)行，簡略步驟如下：對數(shù)生長期的滑膜細(xì)胞，以1×106個／L細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，用白藜蘆醇（0、5、20、50 μmol／L）處理48 h，將細(xì)胞收集于1.5 ml Eppendorf管中，PBS洗滌3次，每次5 min。采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供的DNA Ladder抽提試劑盒提取DNA，取5 μl DNA，75 V，60 min 1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外透射儀下觀察，凝膠成像系統(tǒng)照相。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 滑膜細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定倒置顯微鏡下觀察滑膜細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況，培養(yǎng)24 h后可見貼壁并伸出突起，滑膜細(xì)胞呈梭形。培養(yǎng)7 d后細(xì)胞長滿并對細(xì)胞進(jìn)行傳代。培養(yǎng)24 h后倒置熒光顯微鏡下，傳代滑膜細(xì)胞兔抗鼠VCAM-1多克隆抗體標(biāo)記陽性，細(xì)胞呈梭形，生長狀況良好，核卵圓形，位于細(xì)胞中央。見圖1。

2.2 白藜蘆醇對培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞生長活性的影響

為了探討白藜蘆醇對AA大鼠滑膜細(xì)胞增殖活性的影響，采用CCK-8法檢測傳代滑膜細(xì)胞與不同濃度白藜蘆醇共孵育48 h，檢測滑膜細(xì)胞增殖活性。結(jié)果表明，白藜蘆醇（20、50 μmol／L）能夠顯著地降低AA大鼠滑膜細(xì)胞活力（P＜0.01）。表明高濃度的白藜蘆醇具有誘導(dǎo)AA大鼠滑膜細(xì)胞活性下降的作用。見圖2。

2.3 Hoechst 33258熒光染色結(jié)果白藜蘆醇（0、5、20、50 μmol／L）處理大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞48 h后，經(jīng)紫外光激發(fā)，在熒光顯微鏡下，可見高濃度的白藜蘆醇（20、50 μmol／L）出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，核染色質(zhì)聚集、核碎裂、胞質(zhì)濃縮。而未給藥對照組白藜蘆醇（0 μmol／L）細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光。見圖3。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見未用白藜蘆醇處理組和白藜蘆醇低劑量組（5 μmol／L）僅見離點(diǎn)樣孔不遠(yuǎn)的基因組DNA，而白藜蘆醇高劑量組（20、50 μmol／L）處理滑膜細(xì)胞48 h后，經(jīng)DNA凝膠電泳，可見明顯的DNA梯度條帶。見圖4。

3 討論

滑膜細(xì)胞是關(guān)節(jié)滑膜層的最大細(xì)胞群體，其中最主要的細(xì)胞成分是成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblastlike synoviocyte，F(xiàn)LS），即B型細(xì)胞，占70%～80%，F(xiàn)LS也是RA患者關(guān)節(jié)和軟骨損傷的最終效應(yīng)細(xì)胞。在RA中，滑膜組織過度增生、血管翳侵蝕關(guān)節(jié)軟骨及下面的骨組織［5］。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上［4］，通過組織塊移植法培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，通過貼壁方式去除巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞，以傳代培養(yǎng)方式在體外培養(yǎng)較長時間，獲取較純的FLS。VCAM-1為滑膜細(xì)胞表達(dá)分子標(biāo)記之一，在正常人和RA患者關(guān)節(jié)FLS上均有表達(dá)，而來源于其他組織，如皮膚的成纖維細(xì)胞不表達(dá)VCAM-1［6］。本實(shí)驗(yàn)中，通過傳代培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色反應(yīng)，培養(yǎng)的細(xì)胞中胞質(zhì)VCAM-1陽性，表明FLS培養(yǎng)成功。FLS在體外可傳代培養(yǎng)，本研究所用的滑膜細(xì)胞為第3～5代。

在本實(shí)驗(yàn)中，加入CCK-8試劑的滑膜細(xì)胞，在未加入白藜蘆醇時，其滑膜細(xì)胞增殖活性較高，隨著白藜蘆醇濃度的升高，滑膜細(xì)胞增殖活性逐漸降低，高濃度的白藜蘆醇（20、50 μmol／L）使大鼠滑膜細(xì)胞活力顯著下降，表明高濃度的白藜蘆醇抑制了滑膜細(xì)胞的生長。

熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變可評判細(xì)胞凋亡情況［7］，常用的DNA特異性染料包括Hoechst 33258、DAPI等。Hoechst 33258為特異性DNA染料，通過A-T鍵結(jié)合。本研究觀察到Ho-echst 33258熒光染色在無白藜蘆醇作用下，細(xì)胞核呈彌散、均勻熒光，當(dāng)白藜蘆醇濃度升高至20 μmol／L以上時，滑膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃染致密的顆粒塊狀熒光，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集、碎裂，胞質(zhì)濃縮，白藜蘆醇（50 μmol／L）處理組凋亡的滑膜細(xì)胞明顯增多，表明凋亡增加。

瓊脂糖凝膠電泳是檢測細(xì)胞凋亡的另一種常用方法［8］，正?；罴?xì)胞DNA基因條帶位于加樣孔附近，壞死細(xì)胞其DNA不規(guī)則降解，呈現(xiàn)一條連續(xù)的膜狀條帶。本研究中可見AA模型組滑膜細(xì)胞和低濃度的白藜蘆醇（5 μmol／L）處理組僅見離點(diǎn)樣孔不遠(yuǎn)的基因組DNA，沒有明顯梯狀條帶出現(xiàn)，而高濃度白藜蘆醇（20、50 μmol／L）處理AA大鼠滑膜細(xì)胞48 h后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見規(guī)則的、間隔180～200 bp的凋亡細(xì)胞特征性梯狀條帶。

綜上所述，本研究通過組織塊移植法成功培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，所做相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明白藜蘆醇在一定濃度（≥20 μmol／L）下可以誘導(dǎo)傳代的AA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡，此種現(xiàn)象可以認(rèn)為是白藜蘆醇抵抗滑膜細(xì)胞增生作用的機(jī)制之一。但白藜蘆醇是通過何種途徑來實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡的作用，還有待于進(jìn)一步加以闡明。

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Resveratrol-induced apoptosis of synovial cell in adjuvant arthritis rats

Yang Jun1，2，Zhang Junqiang1，Zhao Huan1，et al
（1Dept of Tissue Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032；
2Dept of Pathology，Anhui Medical College，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on synovial cell proliferation and apoptosis in adjuvant arthritis（AA）rats.Methods0.1 ml of freund′s complete adjuvant was injected into the left foot plantar skin of SD rats to copy the AA model.After 28 days，rats ankle synovial cells were isolated and cultured with tissue pieces culture method，the effect of resveratrol on synovial cell proliferation was detected by CCK-8 method；synovial cells apoptosis was observed by Hoechst 33258 fluorescent dye and agarose gel electrophoresis.ResultsCCK-8 method showed that resveratrol could inhibit the synovial cell proliferation，and showed a trend of dose dependent.High dose of resveratrol（20，50 μmol／L）could induce the apoptosis of synovial cells，apoptotic body of synovial cells nucleus appeared with Hoechst 33258 dyeing，electrophoresis showed ladder-like stripe.ConclusionResveratrol can inhibit AA rats synovial cell proliferation and promote apoptosis of synovial cell which improves the treatment of rheumatoid arthritis.

resveratrol；adjuvant arthritis；synovial cells；cell apoptosis；rats

R 322.72

1000－1492（2015）01－0041－04

2014－09－10接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81373421）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：201310366007）

1安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，合肥2230032安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理學(xué)教研室、3解剖與組胚學(xué)教研室，合肥 2306014安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

楊 珺，女，實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生；陳曉宇，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：cxyayd＠163.com