TGF-β誘導腫瘤細胞上皮-間充質轉化的調節(jié)及信號轉導機制研究進展

任周新，沈俊嶺，李 亞綜述 余海濱審校

綜述

TGF-β誘導腫瘤細胞上皮-間充質轉化的調節(jié)及信號轉導機制研究進展

任周新1，2，沈俊嶺1，2，李 亞1綜述 余海濱1審校

上皮－間充質轉化（EMT）是源于上皮細胞的惡性腫瘤細胞獲得遷徙和侵襲能力的重要生物學過程。惡性上皮性腫瘤細胞和基質細胞分泌的轉化生長因子β（TGF-β）誘導和促進了腫瘤細胞的EMT過程。有研究表明TGF-β借助于Smad依賴性或非Smad依賴性信號轉導通路，誘導或抑制EMT過程關鍵基因的表達；細胞外及細胞膜的多種因子則對上述信號轉導過程產生調節(jié)作用。結果提示，在TGF-β誘導的腫瘤細胞的EMT過程，涉及一個復雜而精細的信號轉導調控網絡。

轉化生長因子β；上皮－間充質轉化；信號轉導

上皮－間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程，是腫瘤侵襲和轉移過程的重要啟動步驟；轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是腫瘤細胞EMT過程的重要誘導因子。在TGF-β的介導下，上皮腫瘤細胞獲得了更多的間充質的表型、喪失了上皮細胞的表型，導致侵襲和遷移能力的提升［1］，從而加速了腫瘤的擴散和發(fā)展，見圖1。近年來針對TGF-β誘導的EMT過程中的信號轉導和調節(jié)機制進行了大量的研究，取得了一定的進展，筆者就這些研究結果作一綜述。

1 TGF-β信號通路

TGF-β超家族包括TGF-β、活化素（activin）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、多種生長與分化因子（growth and differentiation factors，GDFs）等成分，這些成分對細胞的生長、生存、分化和遷移具有調節(jié)作用；在胚胎形成和成年組織的局部內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中，TGF-β也具有重要的作用［2］。TGF-β與某些疾病之間存在密切的聯(lián)系，如自身免疫性疾病、心血管疾病和腫瘤［3］。在腫瘤形成的早期階段，TGF-β通過抑制腫瘤細胞的生長以及促進細胞的凋亡產生抑制效應；但在隨后腫瘤的進展階段，卻促進腫瘤的發(fā)展，這種作用與其誘導腫瘤細胞的EMT有關。例如，上皮腫瘤細胞獲得了更多的間充質的表型并喪失了上皮細胞的表型，導致侵襲和遷移能力的增強［1］，加速了腫瘤的擴散和發(fā)展。此外，TGF-β的促腫瘤形成作用還涉及實體瘤的基質細胞，機制涉及對血管形成的刺激、免疫監(jiān)視的抑制以及炎癥細胞的募集。

TGF-β與細胞膜Ⅰ型和Ⅱ型serine／threonine激酶受體（TGF-βRⅠ／Ⅱ）結合，改變TGF-βRⅠ／Ⅱ的結構，磷酸化并激活胞質內的TGF-βRⅠ激酶，催化受體活化型Smads（如Smad2、Smad3）并使其活化，然后與Smad-4結合形成復合物，進入并積聚于細胞核，在細胞核與其他的轉化因子結合，調節(jié)特定基因的表達。此外，該TGF-β受體活化后，還能磷酸化其他信號通路蛋白，影響其他信號的轉導。如磷酸化Shc的tyrosine活化Ras／MAP-激酶通路；磷酸化Par6的tyrosine導致上皮極性復合物失活。此外，該TGF-β受體復合物形成一個募集泛素激酶TRAF6的信號支架，后者啟動Jun N-terminal激酶和P38 MAP-激酶的信號瀑布［4］。

另外，TGF-β還有非-Smad信號轉導通路，涉及phosphatidylinositol 3’-激酶，the tyrosine kinase Src和小GTPase Rho。另外，TGF-βRⅠ也可能被基質金屬蛋白酶TACE裂解，該裂解方法依賴于泛素連接酶TRAF6和蛋白激酶C，裂解后的TGF-βRⅠ的細胞內部分被轉座到細胞核，調節(jié)腫瘤細胞的侵襲能力［5］。

2 TGF-β和腫瘤EMT

腫瘤細胞進入不同的組織，需要經歷一系列的遷移過程。如從原位癌突破局部上皮細胞基底膜，侵入周圍組織；通過循環(huán)系統(tǒng)轉移；在特定位點從循環(huán)系統(tǒng)中轉移到新的宿主環(huán)境。

與腫瘤有關的EMT的實驗結果存在某些爭議，原因在于EMT過程的短暫、具有可逆轉的性質以及較難識別人類腫瘤樣本中的正在進行EMT轉化的腫瘤細胞。某些研究［3］提示腫瘤的發(fā)展過程與EMT有關。EMT是指在特定的生理和病理情況下，具有極性的上皮細胞向間充質細胞轉化的現(xiàn)象。EMT現(xiàn)象最早于1982年被發(fā)現(xiàn)，研究顯示胚胎期和成年期晶狀體的上皮細胞在三維膠原凝膠中培養(yǎng)可形成偽足，隨后轉變?yōu)殚g充質樣細胞［6］。目前認為EMT是啟動腫瘤轉移反應的關鍵步驟，可參與多種腫瘤（前列腺癌、食管癌及胃癌等）的侵襲、轉移過程。

TGF-β是EMT產生的初始誘導者，之后發(fā)生了廣泛的上皮細胞核的重新編程，產生出progenitorlike特征，細胞之間的連接發(fā)生了改變，以至于原本正常的上皮細胞之間的連接變得易于彎曲和可塑，造成細胞從上皮組織的脫離［3］。上述現(xiàn)象是細胞內外一系列結構變化的結果。在細胞內，微絲、微管和中間絲發(fā)生了結構變化，而在細胞外，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）也發(fā)生了結構改變，這些變化促進了細胞之間形成新的膜連接方式；另外，細胞外基質中的細胞因子、趨化因子等生物活性分子組成和數量也發(fā)生了相應的變化。所有這些變化為腫瘤入侵提供了適宜的微環(huán)境，而且為腫瘤向周圍血管內滲提供了關鍵步驟。

3 細胞外和細胞膜因子共同調節(jié)TGF-β誘導的EMT

沉積于ECM中的靜止形式的TGF-β，通過蛋白裂解方式、與基質和細胞膜蛋白的相互作用方式被活化，活化后與受體結合產生信號［7］。如電離輻射能夠活化靜止狀態(tài)的TGF-β，誘導乳腺癌腫瘤細胞產生EMT［8］。此外，TGF-β表達的調控、相關受體以及信號介質等，均能夠調節(jié)腫瘤細胞對TGF-β的反應能力以及EMT反應的強弱。如CCN5蛋白（一種在細胞質與細胞核之間的往來穿梭的蛋白質），在細胞核內，該蛋白與HDAC1連接，抑制TGF-βRⅡ的表達，因此限制了TGF-β信號通路的作用，產生抑制TGF-β誘導EMT的效應［9］。與之相反，具有促進生長作用的同源框轉錄因子Six1通過轉錄方式誘導TGF-βRⅠ表達，因此Six1活化具有提高TGF-β誘導EMT的效能［10］。

最近的研究［11］表明：其他類型的蛋白，如SCUBE3，能夠與TGF-βRⅡ結合，促進肺癌細胞中的EMT反應并提高癌細胞的侵襲能力。Klotho是一種腎轉膜蛋白，當Klotho的細胞外決定區(qū)伸出細胞膜時，能夠與TGF-βRⅡ結合、阻止信號的轉導，抑制EMT反應；Klotho不僅僅拮抗TGF-β，而且拮抗Wnt和胰島素樣生長因子1信號通路。鑒于這兩條信號通路直接或間接地促進了EMT，因此，Klotho能夠同時阻斷多條誘導EMT信號通路，具有較為廣泛的作用途徑［12］。

與其他研究的廣度和深度相比，TGF-β細胞外和細胞膜調節(jié)因子的研究較為薄弱，有必要深入開展這方面的研究工作，確認抑制和促進TGF-β的調節(jié)因子，了解這些因子的作用機制和效應。然后，從中選擇出適宜的研究對象作為藥物研究的新靶點，建立一條治療腫瘤遷徙和擴散新的藥物研究途徑。

4 TGF-β誘導EMT的信號轉導

TGF-β誘導EMT的信號轉導涉及一個相互交織、精細調節(jié)的蛋白質網絡，不僅Smad而且非Smad通路均可誘導EMT的發(fā)生，其詳細的動力學調節(jié)機制正在研究中［13］。

4.1 Smads參與TGF-β誘導的EMT反應

Smads蛋白存在于胞質中，含有高度保守的N端功能域（Mad-Homology domain 1，MH1）和C端功能域（MH2），前者可與DNA的CAGAC序列結合，后者則與轉錄輔激活蛋白或輔阻遏物相互作用。這兩個功能域之間存在一個富含脯氨酸的連接區(qū)，含有多個磷酸化位點，屬于Smads的負調控區(qū)。Smads介導由胞膜受體轉導入胞核內的TGF-β信號轉導，是細胞內TGF-β信號轉導的關鍵環(huán)節(jié)。

體內和體外研究［14］顯示，R-Smads和Smad4介導TGF-β誘導的EMT反應中的受體的下游信號轉導。需要注意的是不同的Smad分子具有不同的作用。例如，特異性地去除Smad3的角化細胞，產生自發(fā)性的鱗狀細胞癌；另外，對化學性刺激誘發(fā)的皮膚腫瘤，去除Smad3后產生抑制腫瘤的保護作用，后者進一步確定Smad3介導了眾多的致瘤信號傳遞［15］。與之相反，角化細胞中去除Smad2，在化學刺激后，加速細胞的癌變［15］；上述產生的Smad2-表達陰性的鱗狀癌細胞具有EMT眾多標志的病態(tài)分化的特性，E-cadherin的表達受到抑制［15］。對于小鼠的皮膚，Smad2保護上皮細胞避免EMT。這些研究表明，對于皮膚細胞，Smad3誘導或促進EMT而Smad2則抑制EMT或維持上皮特征。

與上述的Smad2抗EMT的保護作用相一致，在人類腎上皮細胞中，使Smad2表達沉默或SARA（一種細胞內的接頭蛋白，能夠促進Smad2連接到TGF-βRⅠ和促進磷酸化過程）沉默，促進EMT的發(fā)生［16］。SARA的丟失，通過泛素連接酶Smurf2和蛋白體的降解，促進Smad2的泛素化。WWP2連接酶也能調節(jié)R-Smad水平，影響EMT反應［17］。另有研究［18］顯示，纖維化肺臟上皮細胞中的EMT依賴于TGF-β受體與integrin α3β1受體之間的相互作用，使磷酸化Smad2-磷酸化β-catenin-轉錄復合因子活化，在體內和體外產生促EMT作用。

核Smad復合物的生物學效應受到蛋白激酶的影響。JNK1有多種同型異構體，在TGF-β引起的EMT反應中，產生不同的影響。JNK2似乎對TGF-β誘導的EMT有抑制作用，如缺乏JNK2的細胞對TGF-β刺激，表現(xiàn)出強烈的EMT反應［3］；JNK1則顯示出促進EMT的效應，如抑制JNK1的表達能夠顯著減輕多種刺激劑誘導的肺氣管上皮細胞的EMT反應［19］。JNK1似乎對帶有AP-1家族成員的Smad轉錄復合物（Jun／Fos）具有催化作用，該復合物作用的目標基因具有重要的促進腫瘤細胞侵襲以及EMT的作用［20］。另外，TGF-β-誘導轉移相關蛋白-1（metastasis-associated protein 1，MTA-1）表達，MTA-1與AP-1復合物相互協(xié)作，引起FosB的轉錄［21］。FosB與HDAC2形成復合物抑制多種乳腺細胞表達E-cadherin，介導了EMT過程。

除了蛋白激酶，特異性的sumo-E3連接酶PIAS1也能調節(jié)TGF-β誘導的EMT反應。TGF-β下調PIAS1并且減少核抑制蛋白SnoN（一個已知的Smad輔助因子）的sumo化修飾［22］。Sumoylation的不足打破了原有的平衡，最終使SnoN降解，導致TGF-β誘導的Smad復合物能夠產生EMT過程所必需的基因調節(jié)作用。與之相反，E3泛素連接酶TIF1γ使Smad4泛素化，導致核Smad復合物的破壞，因此產生拮抗TGF-β誘導的EMT的作用［23］。

在肺腺癌A549細胞中，Smad3與HDAC6的相互作用進一步表明Smad3在TGF-β誘導的EMT中具有促進作用［24］。用藥物抑制劑或siMRA抑制HDAC6或Smad3均會產生抑制EMT反應的效應。HDAC6使微管中的微管蛋白脫去α-乙?；?，對細胞的遷移產生某種影響，但是，是否HDAC6-Smad3共調節(jié)也影響微管的運動或影響EMT的其他表現(xiàn)，這些尚不明確。在A549細胞的EMT過程中，TGF-β能夠下調適配器蛋白胰島素受體底物1（adaptor protein insulin receptor substrate 1，IRS1）［25］。IRS1的過度表達阻斷EMT反應，而用RNAi清除IRS1卻能顯著促進EMT反應，RNAi的作用與提高TGF-β誘導Snail1和Snail2的表達并最終下調E-cadherin的表達有關。其詳細的分子機制可能包括某種磷酸酶磷酸化IRS1或某種其他的降解機制，或者同時涉及這兩個機制［3］。

4.2 非-Smad的介導TGF-β誘導的EMT的路徑

在上皮細胞中，TFG-β通過磷酸化adaptor protein Par6形成了一條信號通路，該通路將TGF-β受體直接與蛋白質的翻譯后修飾和調節(jié)聯(lián)系在一起［26］。磷酸化的Par6募集泛素連接酶Smurf1，該酶降解小GTPase RhoA，導致肌動蛋白微絲結構的變化，破壞了細胞間正常的緊密的連接。

受體連接的泛素連接酶TRAF6介導lysine63-依賴的轉化生長因子β激活激酶1（TGF-beta-activated kinase 1，TAK1）的多泛素化反應。TRAF6的酶促反應，使MAP-激酶-激酶磷酸化并被激活，隨后激活p38MAP激酶和JNK MAP激酶［4］。和TGF-βRⅡ-Par6通路類似，該信號通路也不依賴Smads，參與乳腺上皮細胞的EMT反應［27］。然而，TGFβ受體-TRAF6-TAK1復合物，除了通過MAP激酶途徑還可能通過其他的效應器途徑，介導了促進EMT的信號轉導。例如在初始的間皮細胞里，p38MAP激酶通過抑制TAK1活性和抑制其下游的效應器——即核轉錄因子-κB（NF-κB）。NF-κB是一種重要的核轉錄因子，其活化對于TGF-β誘導的EMT過程產生重要的影響［28］。TRAF6不僅泛素化和激活TGF-β信號下游的TAK1，而且也泛素化直接與之連接的TGF-βRⅠ［5］。該泛素化促進TGF-βRⅠ細胞外受體區(qū)（ICD）的裂解，該區(qū)包括全部的激酶決定區(qū)，隨后促進裂解后的ICD區(qū)運輸到細胞核。在核內，TGF-βRⅠICD通過與共激活因子p-300以及包含眾多基因的染色質結合，調節(jié)轉錄過程，這些基因對EMT和腫瘤入侵有促進作用，如Snail基因［5］。TGF-βRⅠICD與核的Smad復合物共同作用于靶基因，調節(jié)TGF-β誘導的EMT反應。

上述研究結果表明：TGF-β借助于Smad依賴性或非Smad依賴性信號轉導通路誘導或抑制EMT過程關鍵基因的表達；細胞外及細胞膜的多種因子則對上述信號轉導過程產生調節(jié)作用。提示TGF-β誘導的腫瘤細胞的EMT過程涉及一個復雜而精細的信號轉導調控網絡。對其中某些關鍵節(jié)點的有效干預可能為抑制腫瘤細胞的侵襲和遷徙提供新的治療方法。

［1］ Moustakas A，Heldin C H.Induction of epithelial-mesenchymal transition by transforming growth factor β［J］.Semin Cancer Biol，2012，22（5-6）：446－54.

［2］ Moustakas A，Heldin C H.The regulation of TGFβ signal transduction［J］.Development，2009，136（22）：3699－714.

［3］ Gordon K J，Blobe G C.Role of transforming growth factor-β superfamily signaling pathways in human disease［J］.Biochem Biophys Acta，2008，1782（4）：197－228.

［4］ Sorrentino A，Thakur N，Grimsby S，et al.The type I TGF-β receptor engages TRAF6 to activate TAK1 in a receptor kinase-independent manner［J］.Nat Cell Biol，2008，10（10）：1199－207.

［5］ Mu Y，Sundar R，Thakur N，et al.TRAF6 ubiquitinates TGFβ type I receptor to promote its clearage and nuclear translocation in cancer［J］.Nat Commun，2011，2：330.

［6］ Greenburg G，Hay E D.Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells［J］.J Cell Biol，1982，95（1）：333－9.

［7］ Ten Dijke P，Arthur H M.Extracellular control of TGFβ signaling in vascular development and disease［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（11）：857－69.

［8］ Andarawewa K L，Erickson A C，Chou W S，et al.Ionizing radiation predisposes nonmalignant human mammary epithelial cells to undergo transforming growth factor beta induced epithelial to mesenchymal transition［J］.Cancer Res，2007，67（18）：8662－70.

［9］ Sabbah M，Prunier C，F(xiàn)errand N，et al.CCN5，a novel transcriptional repressor of the transforming growth factor β signaling pathway［J］.Mol Cell Biol，2011，31（7）：1459－69.

［10］Micalizzi D S，Wang C A，F(xiàn)arabaugh S M，et al.Home oprotein Six1 increases TGF-β type I receptor and converts TGF-β signaling from suppressive to supportive for tumor growth［J］.Cancer Res，2010，70（24）：10371－80.

［11］Wu Y Y，Peck K，Chang Y L，et al.SCUBE3 is an endogenous TGF-β receptor ligand and regulates the epithelial-mesenchymal transition in lung cancer［J］.Oncogene，2011，30（34）：3682－93.

［12］Doi S，Zou Y，Togao O，et al.Kloto inhibits transforming growth factor-β1（TGF-β1）signaling and suppresses renal fibrosis and cancer metastasis in mice［J］.J Biol Chem，2011，286（10）：8655－65.

［13］Xu J，Lamouille S，Derynck R.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition［J］.Cell Res，2009，19（2）：156－72.

［14］Moustakas A，Heldin C H.Signaling networks guiding epithelialmesenchymal transitions during embryogenesis and cancer progression［J］.Cancer Sci，2007，98（10）：1512－20.

［15］Hoot K E，Lighthall J，Han G，et al.Keratinocyte-specific Smad2 ablation results in increased epithelial-mesenchymal transition during skin cancer formation and progression［J］.J Clin Invest，2008，118（8）：2722－32.

［16］Runyan C E，Hayashida T，Hubchak S，et al.Role of SARA（SMAD anchor for receptor activation）in maintenance of epithelial cell phenol-type［J］.J Biol Chem，2009，284（37）：25181－9.

［17］Soond S M，Chantry A.Selective targeting of activating and inhibitory Smads by distinct WWP2 ubiquitin ligase isoforms differentially modulates TGF-β signaling and EMT［J］.Oncogene，2011，30（21）：2451－62.

［18］Kim Y，Kugler M C，Wei Y，et al.Integrin α3β1-dependent βcatenin phosphorylation links epithelial Smad signaling to cell contacts［J］.J Cell Biology，2009，184（2）：309－22.

［19］van der Velden J L，Guala A S，Leggett S E，et al.Induction of a mesenchymal expression program in lung epithelial cells by wingless protein（Wnt）／β-catenin requires the presence of c-Jun N-terminal kinase-1（JNK1）［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2012，47（3）：306－14.

［20］Alcorn J F，Guala A S，van der Velden J，et al.Jun N-terminal kinase 1 regulates epithelial-to-mesenchymal transition induced by TGF-β1［J］.J Cell Sci，2008，12（Pt7）：1036－45.

［21］Pakala S B，Singh K，Reddy S D，et al.TGF-β1 signaling targets metastasis-associated protein1，a new effector in epithelial cells［J］.Oncogene，2011，30（19）：2230－41.

［22］Netherton S J，Bonni S.Suppression of TGFβ-induced epithelialmesenchymal transition like phenotype by a PIAS1 regulated sumoylation pathway in NMuMG epithelial cells［J］.PLoS One，2010，5（11）：e13971.

［23］Hesling C，F(xiàn)attet L，Teyre G，et al.Antagonistic regulation of EMT by TIF1γ and Smad4 in mammary epithelial cells［J］.EMBO Rep，2011，12（7）：665－72.

［24］Shan B，Yao T P，Nguyen H T，et al.Requirement of HDAC6 for transforminggrowthfactor-β1-inducedepithelial-mesenchymal transition［J］.J Biol Chem，2008，283（30）：21065－73.

［25］Shi J，Wang D M，Wang C M，et al.Insulin receptor substrate-1 suppresses transforming growth factor-β1-mediated epithelial-mesenchymal transition［J］.Cancer Res，2009，69（18）：7180－7.

［26］Viloria-Petit A M，Wrana J L.The TGFβ-Par6 polarity pathway：linking the Par complex to EMT and breast cancer progression［J］. Cell Cycle，2010，9（4）：623－4.

［27］Yamashita M，F(xiàn)atyol K，Jin C，et al.TRAF6 mediates Smad-independent activation of JNK and p38 by TGF-β［J］.Mol Cell，2008，31（6）：918－24.

［28］Strippoli R，Benedicto I，F(xiàn)oronda M，et al.p38 maintains E-cadherin expression by modulating TAK1-NF-κB during epithelial-tomesenchymal transition［J］.J Cell Sci，2010，123（Pt 24）：4321－31.

R 735.2；R 730.231

1000－1492（2015）

2014－07－23接收

國家自然科學基金（編號：81302921）；河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床研究支持項目（編號：2013KJ12）

1河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，2河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，鄭州 450000

任周新，男，高級實驗師；余海濱，男，副主任醫(yī)師，副教授，責任作者，E-mail：yhbzzz＠163.com