風(fēng)濕性心臟瓣膜病合并心房顫動患者中DNMT3A與Kv1.5蛋白的表達(dá)變化及相關(guān)性研究

隨志輝，石開虎，吳君旭，徐盛松，陶 輝，宣海洋，曹 煒，沙紀(jì)名，占紅英

風(fēng)濕性心臟瓣膜病合并心房顫動患者中DNMT3A與Kv1.5蛋白的表達(dá)變化及相關(guān)性研究

隨志輝1，2，石開虎1，2，吳君旭1，2，徐盛松1，2，陶 輝1，2，宣海洋1，2，曹 煒1，2，沙紀(jì)名1，2，占紅英1，2

目的探討風(fēng)濕性心臟瓣膜病合并心房顫動（AF）患者DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）與超速延遲整流性鉀通道蛋白（Kv1.5）表達(dá)水平變化及其相關(guān)性研究。方法將20例風(fēng)濕性心臟瓣膜病接受瓣膜置換手術(shù)患者于體外循環(huán)前切取的右心耳組織作為研究對象，根據(jù)AF的定義將標(biāo)本分為AF組（n＝10）和竇性心律（SR）組（n＝10），分別應(yīng)用免疫組化、Western blot法檢測心房肌組織中DNMT3A和Kv1.5蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果免疫組化檢測顯示AF組與SR組相比，DNMT3A蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；而Kv1.5蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。同時，Western blot檢測顯示AF組與SR組相比，DNMT3A蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），而Kv1.5蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。相關(guān)性分析顯示DNMT3A與Kv1.5之間存在一定負(fù)相關(guān)性（r＝－0.64，P＜0.01）。結(jié)論DNMT3A與Kv1.5之間存在負(fù)相關(guān)性，提示DNMT3A可能參與調(diào)控Kv1.5通道蛋白的表達(dá)。

風(fēng)濕性心臟病；心房顫動；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A；超速延遲整流性鉀通道蛋白

心房顫動是心臟心律失常中常見的一種疾病，可誘發(fā)中風(fēng)和心力衰竭等。超快速延遲整流鉀電流（ultrarapid delayed rectifier current，Ikui）是僅在心房肌發(fā)現(xiàn)的鉀通道電流，其離子通道的分子基礎(chǔ)是Kv1.5鉀通道［1］，有助于研究人類心房肌細(xì)胞的動作電位復(fù)極化。Kv1.5通道阻滯劑可以延長心房動作電位，并可能防止心房撲動或顫動而不影響心室復(fù)極化。而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）是一種甲基化酶，使去甲基化的CpG位點(diǎn)重新甲基化，參與DNA的從頭甲基化。本課題組前期研究［2］顯示DNMT3A參與心肌重構(gòu)過程。該研究通過對風(fēng)濕性心臟瓣膜病合并心房顫動（atrial fibrillation，AF）患者的右心耳DNMT3A蛋白表達(dá)進(jìn)行對比研究，探討DNMT3A與Kv1.5蛋白的表達(dá)變化及相關(guān)性研究，從而揭示風(fēng)濕性心臟瓣膜病患者AF發(fā)生與維持的可能機(jī)制，為臨床更好地防治AF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年12月～2013年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院因風(fēng)濕性心臟瓣膜病施行心臟瓣膜置換手術(shù)的20例患者，排除合并高血壓、糖尿病、心絞痛和慢性腎功能不全者。按有無AF分為AF組和SR組。AF組10例，男4例，女6例，年齡區(qū)間50～62（57.20±3.49）歲；術(shù)前NYHA心功能分級Ⅰ級0例，Ⅱ級2例，Ⅲ級5例，Ⅳ級3例。SR組10例，男3例，女7例，年齡37～60（48.40±6.88）歲；術(shù)前NYHA心功能分級Ⅰ級1例，Ⅱ級6例，Ⅲ級3例。

1.2 主要試劑SP免疫組化試劑盒（北京中杉生物工程有限公司）；兔抗Kv1.5多克隆抗體（美國Millipore公司）；兔抗DNMT3A多克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 心臟彩超檢查 在患者術(shù)前行心臟彩超檢查。儀器：MYLAB 50頻率3.5 MHz。記錄反映心功能的參數(shù)：左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）。記錄心臟若干結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：左房內(nèi)徑（left atrial diameter，LAD）、右房內(nèi)徑（right atrial diameter，RAD）、左室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVDD）、右室內(nèi)徑（right ventricular diameter，RVD）。

1.3.2 免疫組化實驗 取心房肌組織，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm，脫蠟至水；含3%H2O2室溫孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；微波修復(fù)抗原；加入1∶100稀釋的一抗，置濕盒中4℃過夜；1∶100稀釋生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育25 min；DAB顯色：1 ml蒸餾水加入試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間5 min，陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒；蘇木精輕度復(fù)染細(xì)胞核；脫水、透明、中性樹膠封片。采用Image Proplus 6.0圖像掃描軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3.3 Western blot實驗 取右心耳的心房肌組織塊100 mg，加入總蛋白提取液1 ml，勻漿、裂解、離心，即得總蛋白提取液，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白電泳：采?2%分離膠及5%積層膠的SDSPAGE系統(tǒng)；轉(zhuǎn)膜：300 mA恒流電2 h；印跡：洗膜；一抗工作液，37℃孵育過夜，洗膜；二抗工作液，37℃孵育2 h，洗膜；洗片：將A和B發(fā)光液按等體積混合滴于PVDF膜上，壓片、曝光、定影；蛋白半定量檢測：采用Lab Works4.5圖像獲取和分析系統(tǒng)軟件測定DNMT3A與Kv1.5蛋白條帶的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以β-actin作為內(nèi)參照，每個樣品均同時檢測β-actin蛋白條帶的IOD值，計算DNMT3A與Kv1.5的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，所測得數(shù)據(jù)用±s表示。兩組之間定量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，使用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 基本資料AF組患者平均年齡大、病程長，與SR組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；彩色多普勒超聲心動圖資料顯示AF組LAD、RAD、LVDD平均值明顯大于SR組（P＜0.01），AF組LVEF則較低，見表1。

表1 患者心功能各項指標(biāo)對比（n＝10，±s）

與SR組比較：**P＜0.01

項目AF組SR組t值年齡57.2±3.49**48.4±6.883.606性別（男／女）4／63／7－病程（年）15.60±4.97**9.20±4.263.090 LVDD（mm）58.30±5.85**50.50±4.653.161 LAD（mm）49.70±3.65**43.80±4.493.222 RVD（mm）19.50±1.8418.90±2.200.864 RAD（mm）43.70±4.55**38.40±3.472.930 LVEF0.52±0.04**0.59±0.053.010

2.2 免疫組化實驗結(jié)果SR與AF兩組結(jié)果比較，DNMT3A在AF組心肌組織中陽性表達(dá)率為70%，明顯高于SR組20%（P＜0.05）；Kv1.5在AF組心肌組織中陽性表達(dá)率為10%，明顯低于SR組80%（P＜0.05）。見圖1。

2.3 Western blot實驗結(jié)果DNMT3A在AF組心肌組織中表達(dá)明顯高于SR組（P＜0.05）；Kv1.5在 AF組心肌組織中表達(dá)明顯低于SR組（P＜0.05）。見圖2。

2.4 DNMT3A與Kv1.5蛋白的相關(guān)性分析AF發(fā)病過程中的DNMT3A與離子通道蛋白Kv1.5可能存在相互作用，DNMT3A蛋白水平與Kv1.5蛋白水平呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.56，P＜0.01）。

3 討論

AF的病理基礎(chǔ)主要表現(xiàn)為心房纖維化和心房擴(kuò)張，常造成明顯的血流動力學(xué)紊亂和血栓栓塞的發(fā)生。Ikui是構(gòu)成心房肌細(xì)胞復(fù)極化電流的主要成分之一，離子通道的分子基礎(chǔ)就是kv1.5鉀通道［1］，在心房的復(fù)極、ADP時程中起著重要作用，促進(jìn)動作電位復(fù)極，Ikui激活非常快，參與心房復(fù)極的1相和2相，Ikui的減弱會引起APD和ERP的延長，臨床上抑制kv1.5鉀通道就可以防止房顫發(fā)生［3］。

本研究顯示風(fēng)濕性心臟瓣膜病合并AF患者右心耳心房肌組織中Kv1.5蛋白表達(dá)減少。在慢性心房顫動患者心房肌中外向鉀電流密度和Kv1.5的表達(dá)減少，與相關(guān)研究［4］結(jié)果類似。Lai et al［5］的研究表明，包括Kv1.5通道在內(nèi)的多種鉀離子通道基因表達(dá)明顯降低，并伴有APD和ERP的延長。

然而，文獻(xiàn)［6］報道DNA甲基化參與心肌纖維化及房顫的病理過程。成纖維細(xì)胞可能通過增強(qiáng)促纖維化，致使心房纖維化而促進(jìn)慢性房顫［7］。本課題組通過分子生物學(xué)實驗對大鼠心肌纖維化組織中的DNMT3A含量進(jìn)行檢測，顯示模型組心肌組織中的DNMT3A的表達(dá)含量明顯增高。本研究顯示風(fēng)濕性心臟瓣膜病合并AF患者右心耳心房肌組織中DNMT3A蛋白表達(dá)增加，而風(fēng)濕性心臟瓣膜病合并AF患者右心耳心房肌組織中Kv1.5蛋白表達(dá)明顯減少。在慢性心房顫動患者心房肌中外向鉀電流密度和DNMT3A的表達(dá)增加。

通過分析DNMT3A與Kv1.5蛋白表達(dá)的相互關(guān)系，進(jìn)而初步探究DNMT3A在房顫中的作用，房顫的發(fā)生與發(fā)展可能與DNA甲基化有關(guān)，但對于DNMT3A究竟在AF中起何種作用尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明房顫中DNMT3A含量升高可能參與房顫的形成，其機(jī)制可能是通過影響Kv1.5基因甲基化水平，進(jìn)而影響其基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致房顫的發(fā)生發(fā)展。

［1］ Dorian P.Antiarrhythmic drug therapy of atrial fibrillation：focus on new agents［J］.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2003，8（1）：S27－31.

［2］ 汪裕琪，石開虎，吳君旭，等.DNMT3A和Hyp在ISO誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化中的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，49（5）：606－9.

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［6］ Jiang J X，Aitken K J，Sotiropolous C，et al.Phenotypic switching induced by damaged matrix is associated with DNA methyltransferase 3A（DNMT3A）activity and nuclear localization in smooth muscle cells（SMC）［J］.PLoS One，2013，8（8）：e69089.

［7］ Xie X，Liu Y，Gao S，et al.Possible involvement of fibrocytes in atrial fibrosis in patients with chronic atrial fibrillation［J］.Circ J，2014，78（2）：338－44.

Study on the expression correlation between DNMT3A and Kv1.5 in the patients with rheumatic heart disease and atrial fibrillation

Sui Zhihui1，2，Shi Kaihu1，2，Wu Junxu1，2，et al
（1Dept of Cardiothoracic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；
2Cardiovascular Disease Research Center of Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the expression correlation between DNA methyltransferase 3A（DNMT3A）and rapid delayed rectifier potassium channel（Kv1.5）in the patients with rheumatic heart disease and atrial fibrillation（AF）.MethodsTissues of auricula dextra were removed from 20 patients with rheumatic heart disease undergoing cardiac surgery for correction to valvular defect.According to the definition of AF（n＝10），20 patients were divided into groups of AF and of sinus rhythm（SR）（n＝10）.Expressions of DNMT3A and Kv1.5 were detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the group of SR，the expression of DNMT3A protein was significantly enhanced（P＜0.05）whereas Kv1.5 decreased（P＜0.05）in the results by immu-nohistochemistry.Meanwhile，the results from Western blot also showed increased DNMT3A（P＜0.05）and reduced Kv1.5（P＜0.05）in the group of AF.And negative correlation between the expression of DNMT3A and Kv1.5 was shown with correlation analysis（r＝－0.64，P＜0.01）.ConclusionThe negative correlation exists in the expression of DNMT3A and Kv1.5，which indicates that DNMT3A can regulate the expression of Kv1.5.

rheumatic heart disease；atrial fibrillation；DNA methyltransferase；rapid delayed rectifier potassium channel

R 654.2

1000－1492（2015）01－0105－04

2014－10－15接收

安徽省自然科學(xué)基金項目（編號：1308085MH117）；安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項目（編號：KJ2011A175）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，合肥 2306012安徽醫(yī)科大學(xué)心血管病研究中心，合肥 230032

隨志輝，男，主治醫(yī)師，碩士研究生； 石開虎，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shikaihu＠gmail.com