NF-κB沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖

潘紅杰，范才文，易世江，李 璐，劉建翔，王建紅，羅 琴，向 秋

NF-κB沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖

潘紅杰1，范才文1，易世江2，李 璐1，劉建翔1，王建紅1，羅 琴1，向 秋

目的探討核因子-κB（NF-κB）沉默對鼻咽癌5-8F細胞的增殖抑制作用。方法構(gòu)建NF-κB p65沉默重組質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2-NF-κB和陰性對照重組質(zhì)粒載體pGenesil-1.2-HK，應用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染人鼻咽癌5-8F細胞，采用Western blot法檢測NF-κB p65的表達，采用MTT及流式細胞儀分析細胞增殖和細胞周期。結(jié)果NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖，抑制率為（58.43±1.24）%，與對照組細胞抑制率（0）和陰性對照組細胞抑制率（17.89±4.13）%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NF-κB沉默組S期細胞為（42.27±0.39）%，與空白對照組（30.83±1.36）%和陰性對照組（34.88±0.85）%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖，其可能是通過S期細胞阻滯起作用。

NF-κB；鼻咽癌；siRNA

核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是Rel／NF-κB家族中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。煙草、飲食和環(huán)境等多種因素能激活NF-κB［1］。研究［2］顯示，在淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等組織中均發(fā)現(xiàn)活化的NF-κB。沈斌等［3］研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌中NF-κB p65高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良預后有關(guān)。何曉松等［4］發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）下調(diào)NF-κB p65表達后，鼻咽癌移植瘤對放療的敏感性增強。抑制NF-κB活性，阻止腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡。該研究選取NF-κB基因作為研究靶點，探討NF-κB p65基因沉默對鼻咽癌5-8F細胞生物學行為的影響，為NF-κB在鼻咽癌中的作用和功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鼻咽癌5-8F細胞系和大腸桿菌JM109均由桂林醫(yī)學院科學實驗中心保種；質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2購自武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司；高純度質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent購自Qiagen公司；DMSO、MTT購自美國Sigma公司；鼠抗人NF-κB p65一抗購自Bioworld公司；小鼠抗人GAPDH一抗、辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自Millipore公司；ECL發(fā)光液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 NF-κB特異性SiRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中人NF-κB p65的表達序列，設(shè)計、合成2條NF-κB特異性干擾序列，構(gòu)建NF-κB特異性沉默重組質(zhì)粒表達載體（pGenesil-1.2-NF-κB），正義鏈：5’-ATGGACAGCACATGCGCTGACTGATAGCCTGCGGGAAAGAGTGATCTC-3’；反義鏈：5’-CCC AAGCTTAAAAAGCAGGCTATCAGTCAGCGCATGGA CAGCACAT-3’。正義鏈：5’-AATCTCTTGAATTT ACGTTTCTCCTCAATCCGGGTGTTTCGTCCTTTC-3’；反義鏈：5’-GCGGATCCAAAAACGGATTGAGGAGA AACGTAAATCTCTTGAATT-3’。

同時設(shè)計1條陰性對照序列（HK），構(gòu)建陰性對照重組質(zhì)粒表達載體（pGenesil-1.2-HK），該序列與人的基因序列無同源性。正義鏈：5’-CCTCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTA TGAAGTCTTTTTTG-3’，反義鏈：5’-AGCTCAAAA AAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGC GCCTTATGAAGTC-3’，將合成的干擾序列正義鏈和反義鏈退火，合成雙鏈DNA干擾片段，將干擾DNA片段亞克隆到pGenesil-1.2質(zhì)粒表達載體上，構(gòu)建重組NF-κB p65特異性抑制的質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2-NF-κB和重組陰性表達質(zhì)粒載體pGenesil-1.2-HK。

1.3 實驗分組及細胞轉(zhuǎn)染

1.3.1 實驗分組 實驗設(shè)空白對照組（未轉(zhuǎn)染載體的5-8F細胞）、陰性對照組（轉(zhuǎn)入pGenesil-1.2-HK質(zhì)粒表達載體的5-8F細胞）、實驗組（轉(zhuǎn)入pGenesil-1.2-NF-κB質(zhì)粒表達載體的5-8F細胞）。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染 人鼻咽癌5-8F細胞采用RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清，100 U／ml青霉素，100 μg／ml鏈霉素）培養(yǎng)，0.25%胰酶消化細胞，將細胞接種于6孔板，接種密度為5×104／ml，每孔2 ml。細胞融合達60%～80%時，應用Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的pGenesil-1.2-NF-κB和pGenesil-1.2-HK重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)入鼻咽癌5-8F細胞，重組質(zhì)粒終濃度為0.25 μg／ml，然后于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于pGenesil-1.2載體表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），轉(zhuǎn)染48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效果。

1.4 Western blot法檢測NF-κB p65表達細胞轉(zhuǎn)染48 h后，去上清液，細胞用適量通用蛋白裂解液裂解，置冰上15 min，收集細胞裂解液，4℃、12 000 r／min離心30 min，收集上清液。采用BCA法測定總蛋白濃度。蛋白上樣后，采用100 V進行10%SDS-PAGE電泳分離，恒流260 mA，濕轉(zhuǎn)1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入NF-κB p65一抗（1：500），70 r／min，2 h；用TBST洗4次，每次8 min，加入辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗，70 r／min，1.5 h，TBST洗4次，每次8 min，采用ECL發(fā)光試劑進行發(fā)光，然后進行圖像分析。同樣操作檢測GAPDH表達。

1.5 MTT法檢測細胞增殖0.25%胰酶消化細胞，調(diào)整細胞密度至2.5×104／ml，接種于96孔板，每孔接種5 000個。每組設(shè)3個復孔，細胞轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入MTT（5 mg／ml）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸去上清液，每孔加入200 μl DMSO，振蕩10～15 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標儀（490 nm波長）測定各孔的吸光度值（OD值）。計算細胞生長抑制率（IR）＝［1－（實驗組OD值／對照組OD值）］× 100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期細胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗滌細胞3次，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，1 000 r／min離心5 min，PBS洗滌2次，加70%預冷的乙醇溶液，－20℃固定過夜，1 000 r／min離心10 min，棄去乙醇，PBS洗滌2次，加入400 μl RNase A，37℃水浴30 min，加入PI染液，避光染色30 min，200～300目篩網(wǎng)過濾，采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)以±s示。多組間均數(shù)比較采用（One-Way ANOVA）完全隨機的單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 重組表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細胞判別重組pGenesil-1.2-HK、pGenesil-1.2-NF-κB質(zhì)粒表達載體帶有GFP，轉(zhuǎn)入細胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)綠色熒光。見圖1。

2.2 pGenesil-1.2-NF-κB轉(zhuǎn)染抑制5-8F細胞NF-κB p65表達pGenesil-1.2-NF-κB轉(zhuǎn)染鼻咽癌5-8F細胞，NF-κB p65蛋白表達抑制，與對照組和陰性對照組比較，蛋白表達抑制明顯。見圖2。

2.3 NF-κB沉默對5-8F細胞增殖的影響NF-κB沉默抑制5-8F細胞增殖，抑制率為（58.43± 1.24）%，與空白對照組抑制率（0）和陰性對照組抑制率（17.89±4.13）%比較，差異有統(tǒng)計學意義（F＝1 971.46，P＜0.05）。

2.4 NF-κB沉默對5-8F細胞周期的影響NF-κB沉默，5-8F細胞呈現(xiàn)S期阻滯，S期細胞為（42.27± 0.39）%與對照組（30.83±1.36）%和陰性對照組（34.88±0.85）%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖3。

表1 流式細胞儀分析細胞周期（48 h）（%，n＝3，±s）

與陰性對照組、空白對照組比較：*P＜0.05

組別G1期F值G2期F值S期F值空白對照59.37±1.309.80±0.6330.83±1.36陰性對照56.13±1.30 33.83 9.00±0.46 39.34 34.88±0.85 110.97實驗52.14±0.365.59±0.7342.27±0.39*

3 討論

鼻咽癌是一種好發(fā)于鼻咽黏膜的惡性腫瘤。由于鼻咽癌發(fā)病十分隱匿，早期癥狀和體征不明顯，缺乏有效的早期診斷方法，絕大多數(shù)病例在就診時已屬中晚期，治療效果仍不佳，Ⅳ期鼻咽癌患者5年生存率為30%～50%［5］。深入研究鼻咽癌發(fā)病的分子機制，尋找新的治療方法是提高鼻咽癌整體療效的關(guān)鍵。siRNA技術(shù)是將一段與目的基因同源的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）導入細胞，使mRNA發(fā)生特異性的降解，從而實現(xiàn)序列特異性沉默［6］。方法簡單易行、快速、有效、序列特異性強等優(yōu)點，并且導入多種dsRNA可以同時敲除多個基因，細胞轉(zhuǎn)染后幾天就可觀察到靶向基因沉默后的生物學現(xiàn)象。該研究所用的pGenesil-1.2載體帶有GFP，在倒置熒光顯微鏡下，通過觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況，并分析細胞的轉(zhuǎn)染效率，5-8F細胞轉(zhuǎn)染效率為70%～80%。

NF-κB作為一類核轉(zhuǎn)錄因子，多以P50／p65二聚體的形式存在［7］。當細胞在非刺激狀態(tài)下，NF-κB與它的抑制物IκB結(jié)合，并以一種靜息的形式存在于細胞質(zhì)，當細胞受到損傷等刺激后，IκB降解，活化的NF-κB釋放并轉(zhuǎn)移至細胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［8］。許多癌癥患者的癌組織中均發(fā)現(xiàn)活化的NF-κB，如白血病、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等［9］。資料顯示，在腫瘤發(fā)展的后期階段，使用IκB的超級抑制物進行誘導，抑制NF-κB的活化，導致轉(zhuǎn)化的肝細胞發(fā)生細胞凋亡，進而阻滯肝細胞癌的進展［10］。該研究通過構(gòu)建NF-κB p65沉默重組質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2-NF-κB，觀察其轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞后的生物學作用。Western blot檢測表明：pGenesil-1.2-NF-κB質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染抑制5-8F細胞NF-κB p65表達，與空白對照組和陰性對照組比較，NF-κB p65蛋白表達明顯下降。說明NF-κB p65 siRNA能抑制5-8F中NF-κB p65蛋白的表達。干擾表達載體轉(zhuǎn)染細胞48 h，實驗組細胞增殖抑制率為（58.43±1.24）%，明顯高于空白對照組抑制率（0）和陰性對照組抑制率（17.89±4.13）%。NF-κB質(zhì)粒表達干擾載體轉(zhuǎn)染，抑制5-8F細胞增殖，呈現(xiàn)S期阻滯。作者構(gòu)建的NF-κB特異性干擾質(zhì)粒表達載體能沉默NF-κB基因，抑制細胞增殖，為鼻咽癌的靶向治療提供了實驗基礎(chǔ)。

［1］ Gupta S C，Sundaram C，Reuter S，et al.Inhibiting NF-kappaB activation by small molecules as a therapeutic strategy［J］.Biochim Biophys Acta，2010，29（3）：775－87.

［2］ Kannappan R，Gupta S C，Kim J H，et al.Tocotrienols fight cancer by targeting multiple cell signaling pathways［J］.Genes Nutr， 2011，7（1）：43－52.

［3］ 沈 斌，董 頻，英信江，等.ABCG2和NF-κB p65在鼻咽癌中的表達及其意義［J］.臨床腫瘤學雜志，2012，17（5）：424－7.

［4］ 何曉松，易世江，凌月福，等.實EGCG抑制NF-κB的表達增強鼻咽癌裸鼠移植瘤對放療的敏感性［J］.實用醫(yī)學雜志，2010，26（16）：2905－7.

［5］ 蘇勝發(fā).鼻咽癌治療進展［J］.腫瘤預防與治療，2010，23（1）：66－70.

［6］ 侯程浩，陶 蓉，史立宏，等.穩(wěn)定表達siRNA-NUAK1基因95D細胞系的建立［J］.青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，44（1）：1－4.

［7］ Gupta S C，Sundaram C，Reuter S，et al.Inhibiting NF-kappaB activation by small molecules as a therapeutic strategy［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1799（10）：775－87.

［8］ Garg A，Aggarwal B B.Nuclear transcription factor-kappaB as a target for cancer drug development［J］.Leukemia，2002，16（6）：1053－68.

［9］ Aggarwal B B，Gehlot P.Inflammation and cancer：How friendly is the relationship for cancer patients？［J］Curr Opin Pharmacol，2009，9（4）：351－69.

［10］Tergaonkar V，Pando M，Vafa O，et al.P53 stabilization is decreased upon NF-kappaB activation：a role for NF-kappaB in acquisition of resistance to chemotherapy［J］.Cancer Cell，2002，1（5）：493－503.

NF-κB silencing inhibits the proliferation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cell

Pan Hongjie1，F(xiàn)an Caiwen1，Yi Shijiang2，et al
（1Dept of Pathology and Pathophysiology，Guilin Medical College，Guilin 541004；2Dept of Otorhinolaryngology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001）

ObjectiveTo evaluate the inhibition effects of nuclear factor-κB（NF-κB）silencing in the nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.MethodsConstructing the NF-κB SiRNA expression vector pGenesil-1.2-NF-κB and emptor pGenesil-1.2-HK，and then they were transfected into nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.Western blot was used to detect expression of NF-κB p65 protein.MTT and flow cytometry were used to evaluate the proliferation inhibition and the cell cycle arrest in 5-8F cells respectively.ResultsNF-κB p65 silencing could inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells and the inhibition rate was（58.43±1.24）%，0%in the control group and（17.89±4.13）%in the empty vector control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.The cell number of S phase was（42.27±0.39）%in NF-κB silencing group，（30.83±1.36）%in the control group and（34.88±0.85）%in the empty vector control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe NF-κB p65 knockdown decrease cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells，maybe due to cell cycle arresting in S phase.

nuclear factor-κB；nasopharyngeal cancer；siRNA

R 739.6

1000－1492（2015）01－0016－04

2014－09－27接收

國家自然科學基金（編號：81260344）；廣西研究生教育創(chuàng)新項目（編號：YCSZ2012110）；廣西高等學校優(yōu)秀人才資助計劃項目；廣西自然科學基金（編號：2013GXNSFAA019228）；桂林市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（編號：20130120-19）

1桂林醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，桂林 5410042桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，桂林 541001

潘紅杰，女，碩士研究生；向 秋，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：guilin996＠163.com