運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的大鼠海馬氧化應(yīng)激的影響

李靖

(巢湖學(xué)院體育學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的大鼠海馬氧化應(yīng)激的影響

李靖

(巢湖學(xué)院體育學(xué)院，安徽 巢湖 238000）

背景：氧化應(yīng)激形成誘導(dǎo)多細(xì)胞通路的基礎(chǔ)，其能導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥，最能導(dǎo)致身體虛弱的疾病——是神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究的目的是評(píng)價(jià)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)是否能減輕鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡率。方法：40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，即對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)組、糖尿病組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組，通過給大鼠注射鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病模型。所有運(yùn)動(dòng)組大鼠在動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)上進(jìn)行8周運(yùn)動(dòng)，在8周末，大鼠海馬在冰凍中立即分離并冷凍保存。收集上清液于-80°C保存，用于測(cè)定抗氧化酶和TBARs，用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞死亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果：糖尿病不運(yùn)動(dòng)組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組的TBARs水平顯著高于對(duì)照組；運(yùn)動(dòng)組SOD和GPx顯著增高，糖尿病不運(yùn)動(dòng)組顯著降低；與對(duì)照組相比，糖尿病不運(yùn)動(dòng)組CAT活性顯著降低；與對(duì)照組相比，糖尿病不運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞凋亡率顯著增加，運(yùn)動(dòng)組顯著降低。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠產(chǎn)生有益影響，部分原因可能是因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激適應(yīng)能力的改變。

氧化應(yīng)激；糖尿??；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；凋亡；海馬

1 前言

糖尿病是世界上一個(gè)重要的醫(yī)療問題，影響超過1.65億人，導(dǎo)致心血管疾病、腎病、視網(wǎng)膜病變和廣泛的周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能成為最能導(dǎo)致身體虛弱的并發(fā)癥之一，會(huì)影響大腦敏感認(rèn)知區(qū)域，如海馬，其調(diào)節(jié)記憶功能，呆滯顯著的功能障礙和癡呆。氧化應(yīng)激是形成誘導(dǎo)多細(xì)胞通路形成的基礎(chǔ)，能最終導(dǎo)致糖尿病發(fā)生和后繼并發(fā)癥[1]。

海馬突觸可塑性和傳遞性缺損導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶損害是糖尿病中樞系統(tǒng)并發(fā)癥的表現(xiàn)[2]。越來越多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究證據(jù)表明氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)生和后繼并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變中起關(guān)鍵作用[3]。

活性氧和氮族，即過氧化物、羥自由基、過氧化氫和一氧化氮(NO）的產(chǎn)生是中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理代謝反應(yīng)的結(jié)果。超氧自由基被超氧物歧化酶(SOD）轉(zhuǎn)換為過氧化氫，過氧化氫被谷胱甘肽過氧化物酶(GPx）和/或過氧化氫酶轉(zhuǎn)換為水[4]。過氧化氫能穿過所有細(xì)胞膜，在更遠(yuǎn)位置導(dǎo)致羥自由基形成。羥自由基能引起脂質(zhì)過氧化，損害細(xì)胞器和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。NO被超氧自由基快速破壞，其活性在SOD存在下增高[5]。

因?yàn)槠涓哐跸穆?，大腦尤其易受氧化損傷，過度的活性自由基產(chǎn)生和高水平轉(zhuǎn)換金屬，如鐵，催化活性自由基產(chǎn)生。此外，神經(jīng)膜富含多不飽和脂肪酸，這是脂質(zhì)過氧化的一個(gè)來源[6]。糖尿病患者的葡萄糖氧化、非酶糖基化蛋白和隨后的糖基化蛋白氧化降解反應(yīng)，會(huì)不成比例的形成自由基。自由基水平的異常升高，同時(shí)抗氧化防御機(jī)制下降能導(dǎo)致細(xì)胞器和酶的損傷、脂質(zhì)過氧化的增加和胰島素抵抗的形成。氧化應(yīng)激的這些后果能促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[7]。

一些研究表明，規(guī)律的適度的身體活動(dòng)會(huì)對(duì)大腦產(chǎn)生有益的影響[8]。運(yùn)動(dòng)能刺激海馬中的神經(jīng)發(fā)生、改善學(xué)習(xí)和記憶[9-11]。據(jù)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)能增強(qiáng)健康和糖尿病動(dòng)物海馬的細(xì)胞增殖[12-13]。最近，有研究指出運(yùn)動(dòng)可能防止鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬突觸可塑性損害[2]?？梢哉J(rèn)為規(guī)律運(yùn)動(dòng)增加氧化酶活性、增加抵抗氧化應(yīng)激，因此降低細(xì)胞氧化損害[14]。

據(jù)筆者所知，目前缺少規(guī)律運(yùn)動(dòng)影響糖尿病大鼠海馬氧化應(yīng)激和凋亡的研究證據(jù)。當(dāng)前的研究目的是檢驗(yàn)跑臺(tái)跑是否能減輕鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠海馬中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡率。

2 材料與方法

40只雄性Wistar大鼠，2月齡，平均體重190±12 g，購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。大鼠室內(nèi)飼養(yǎng)，室溫控制在23±2°C，12小時(shí)光照循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。

大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，即對(duì)照組(不運(yùn)動(dòng)）、運(yùn)動(dòng)組、糖尿病組(不運(yùn)動(dòng)）和糖尿病運(yùn)動(dòng)組。所有運(yùn)動(dòng)組大鼠在動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)上進(jìn)行8周運(yùn)動(dòng)，坡度為0%，速度為17m/min，每天40min，每周7天[2]。運(yùn)動(dòng)組大鼠接受運(yùn)動(dòng)計(jì)劃的同時(shí)，糖尿病組大鼠每天放置于跑臺(tái)上10 min，熟悉跑臺(tái)環(huán)境。為了建立糖尿病大鼠模型，大鼠腹膜內(nèi)注射50 mg/kg鏈脲霉素(STZ），對(duì)照組大鼠注射生理鹽水。STZ注射后2天，用血糖測(cè)試儀測(cè)定血糖水平，大鼠血糖水平≥300 mg/dl為建模成功(表1）。所有大鼠在建模成功后8周解剖。

運(yùn)動(dòng)組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組大鼠在最后一次運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)，所有大鼠乙醚麻醉，斷頭。迅速分離海馬，1 mL冰凍預(yù)冷的裂解緩沖液 (10 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，20 mM HEPES，20%甘油，0.1%Triton X-100，1mM二硫蘇糖醇，pH=7.4）中勻漿。勻漿后于4°C，1000 rpm分離1 min。收集含有細(xì)胞質(zhì)蛋白的上清液，加入蛋白酶抑制劑混合物 (104 mM AEBSF，0.08 mM抑肽酶，2 mM亮肽素，4 mM抑氨肽酶b，1.5 mM胃酶抑素A和1.4 mM E-64）于-80℃保存。用Bradford法評(píng)估上清液蛋白濃度[15]。

通過測(cè)定勻漿中硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARs）分析脂質(zhì)過氧化[16]。簡(jiǎn)單的說，樣本與1 mL10%的三氯乙酸和1 mL0.67%的硫代巴比妥酸混合。接著樣本在沸水浴中加熱15 min，加丁醇(2∶1，v∶v）于溶液中。800 g，離心5 min后，在535 nm吸光度測(cè)定TBARs。

用Griffith法測(cè)定海馬中谷胱甘肽濃度。勻漿制備如下：海馬在5 vol.1%三氯乙酸(w/v）中勻漿，接著以18000 g離心10 min。為了測(cè)定總谷胱甘肽，等分上清液稀釋1/50，10 μL制劑加入含有0.21 mM NADPH，0.6 mM5，5￠-二巰代(2-硝基苯甲酸），5 mM EDTA，和0.5 U谷胱甘肽還原酶的100 mM磷酸鈉緩沖液，pH=7.5的混合物，最終容積為1 mL。記錄412 nm吸光度。與谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算總谷胱甘肽[17]。

用RANSOD試劑盒測(cè)定超氧物歧化酶(SOD）活性[18]。上清液中SOD活性用分光光度計(jì)在505 nm處測(cè)定。依據(jù)這種方法，用葉黃素和葉黃素氧化酶產(chǎn)生超氧自由基，與碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT）反應(yīng)形成紅色甲臜。葉黃素的底物濃度為0.05 mmol/L，INT底物濃度為0.025 mmol/L。通過這個(gè)反應(yīng)的抑制程度測(cè)定SOD活性。

用RANSEL試劑盒測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶(GPx）活性[19]。通過過氧化氫異丙苯，GPx催化谷胱甘肽氧化(濃度為4 mmol/L）。在谷胱甘肽還原酶(濃度為0.5 units/L）和0.28 mmol/L NADPH存在條件下，氧化型谷胱甘肽立即轉(zhuǎn)換為還原形式，同時(shí)NADPH氧化為NAD+。用分光光度計(jì)測(cè)定340 nm處吸光度。之前，海馬勻漿4°C，1000 g離心10 min。

過氧化氫酶活性(CAT）測(cè)定方法如文獻(xiàn)所述[20]。H2O2分解后直接降低20°C，于240 nm測(cè)吸光度。適量上清液(60 μL相當(dāng)于1.5 mg濕組織）加入反應(yīng)混合物，含有0.002%Triton X-100，0.1 mm EDTA，0.5 m磷酸氫二鉀緩沖液，pH=7.0和15 mm H2O2，最終容積1 mL。用最初30 s分解率計(jì)算活性。

根據(jù)試劑盒的說明，用細(xì)胞凋亡檢測(cè)ELISA試劑盒定量測(cè)定細(xì)胞質(zhì)組蛋白相關(guān)DNA片段。簡(jiǎn)要的說，萃取的海馬細(xì)胞質(zhì)作為酶聯(lián)免疫雙抗原夾心法的抗原與一抗組蛋白鼠單克隆抗體涂層微量滴定板和二抗DNA鼠單克隆抗體配對(duì)的過氧化物酶。在20°C，免疫復(fù)合物與2，2-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽(ABTS）孵化10 min，分光光度計(jì)于405 nm下測(cè)的定固定的過氧化物酶色澤變化。所有測(cè)量進(jìn)行雙份，對(duì)照組和訓(xùn)練組樣本的分析在相同的微量滴定板上、相同環(huán)境中進(jìn)行。接著OD405讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為樣本中總蛋白量。OD405/mg蛋白作為細(xì)胞凋亡指數(shù)，表示細(xì)胞漿單體和寡核苷酸酶的水平。

3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的常態(tài)分布，用單因素ANOVA分析組間差異，變量包括TBARs、抗氧化酶和細(xì)胞凋亡指數(shù)。當(dāng)獲得顯著性P值時(shí)，Tukey post-hoc檢驗(yàn)確定組間差異。設(shè)P＜0.05為統(tǒng)計(jì)顯著性。

4 結(jié)果

圖1顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組TBARs水平顯著增高(p=0.001），但運(yùn)動(dòng)的TBARs水平?jīng)]有變化。雖然運(yùn)動(dòng)組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相比，海馬GSH水平?jīng)]有變化(表2），但是與對(duì)照組(p=0.009）和運(yùn)動(dòng)組(p= 0.004）相比，糖尿病組GSH水平顯著降低。

研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬SOD活性顯著增高 (p=0.001），糖尿病組SOD活性顯著降低(p=0.004）(表2）。雖然與對(duì)照組相比，糖尿病運(yùn)動(dòng)組SOD活性降低(p=0.032），但是比糖尿病組高(p=0.041）。

如同SOD活性，運(yùn)動(dòng)組海馬GPX活性增加(p=0.009），糖尿病組降低(p=0.019）。雖然與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組GPX活性沒有變化，但是高于糖尿病組(p=0.029）。

與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠海馬CAT活性顯著降低(p=0.001）。然而，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組CAT活性顯著增高(p=0.004）。與對(duì)照組相比，糖尿病運(yùn)動(dòng)組CAT活性沒有變化，但是與糖尿病組相比，顯著增高(p=0.002）。

5 討論

當(dāng)前的研究中，糖尿病與海馬脂質(zhì)過氧化增加相關(guān)，其是一個(gè)已知的氧化應(yīng)激標(biāo)志，伴隨抗氧化酶SOD、GPX和CAT顯著下降。另外，糖尿病引起GSH水平顯著增加，海馬細(xì)胞凋亡率也顯著增加。

糖尿病大鼠TBARs水平增高，表明氧化應(yīng)激增加，預(yù)期抗氧化劑活性增加。研究發(fā)現(xiàn)SOD、GPX和CAT降低，表明這些酶的活性受糖尿病的影響。先前的研究表明，糖尿病誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，大腦和海馬中抗氧化酶活性和能力減少[3][21-22]。然而，Ramanathan等報(bào)道，誘導(dǎo)糖尿病后72 h，SOD和CAT活性增加，GPX活性沒有變化[23]。相反，在誘導(dǎo)糖尿病后1個(gè)月，CAT活性增加，GPX活性降低，SOD活性沒有變化。筆者測(cè)定誘導(dǎo)糖尿病后2個(gè)月的抗氧化酶活性。Lappalainen等報(bào)道，誘導(dǎo)糖尿病后2個(gè)月，大鼠大腦中的谷胱甘肽還原酶降低，GPX活性增高，CAT和SOD活性沒有變化[21]。但是，筆者測(cè)定海馬中的這些酶活性，大腦不同區(qū)域這些酶活性可能不同[24]。

在凋亡神經(jīng)病變過程中，氧化應(yīng)激是一個(gè)關(guān)鍵的參與者，伴隨代謝受損和興奮性中毒[25]。氧化應(yīng)激過程中，幾個(gè)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成，這些涉及神經(jīng)死亡和成為GSH的一個(gè)中間底物，聚集進(jìn)一步的氧化應(yīng)激[6]。GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化分子，是構(gòu)成抗氧化應(yīng)激的一個(gè)重要機(jī)制[21]。 GSH水平降低與凋亡神經(jīng)死亡有關(guān)[26]。本研究結(jié)果與這個(gè)想法一致，與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠海馬GSH率顯著降低和細(xì)胞凋亡顯著增加。Lappalaine等報(bào)道，糖尿病通過GSH減少誘導(dǎo)大鼠大腦氧化應(yīng)激[21]。此外，Piotrowski等描述細(xì)胞凋亡蛋白酶-3活性，是凋亡細(xì)胞死亡的一個(gè)關(guān)鍵酶，糖尿病大鼠的海馬中升高[27]。這些數(shù)據(jù)顯示，糖尿病導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可能誘導(dǎo)海馬細(xì)胞凋亡。

筆者研究表明，非糖尿病運(yùn)動(dòng)大鼠比對(duì)照組有更高的SOD、GPX和CAT活性。而且，與對(duì)照組相比，非糖尿病運(yùn)動(dòng)組細(xì)胞凋亡率顯著降低。非糖尿病運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組的TBARs水平?jīng)]有差異，表明規(guī)律運(yùn)動(dòng)不能影響過氧化指數(shù)。Aksu等也報(bào)道，規(guī)律運(yùn)動(dòng)沒有引起大鼠海馬的氧化應(yīng)激，通過降低超氧化自由基形成對(duì)海馬有一個(gè)有利影響[28]。另一方面，Lappalainen等報(bào)道，8周運(yùn)動(dòng)后大腦中的抗氧化酶 (除了谷胱甘肽還原酶）沒有增加[21]。這個(gè)差異可能是由方法不同、評(píng)價(jià)大腦區(qū)域不同、運(yùn)動(dòng)計(jì)劃不同和最后一次運(yùn)動(dòng)與動(dòng)物處死之間的時(shí)間不同產(chǎn)生的。

筆者也研究了運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的大鼠海馬氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果顯示規(guī)律運(yùn)動(dòng)有效地預(yù)防大鼠海馬抗氧化酶活性和GSH水平降低。Lappalainen等研究顯示，規(guī)律運(yùn)動(dòng)沒有影響大鼠大腦中SOD、GPX和CAT活性[21]。這個(gè)差異的原因不清楚，但是可能歸因于運(yùn)動(dòng)對(duì)大腦不同區(qū)域的不同效應(yīng)或評(píng)價(jià)方法的不同和運(yùn)動(dòng)計(jì)劃的不同。

研究結(jié)果表明，規(guī)律運(yùn)動(dòng)防止糖尿病大鼠海馬中脂質(zhì)過氧化的增加和細(xì)胞凋亡率增加。關(guān)于抗氧化酶活性的增加，可能是防止凋亡增加而導(dǎo)致氧化應(yīng)激降低的產(chǎn)生。先前，有人提出涉及氧化應(yīng)激與海馬細(xì)胞凋亡的建議[29]，Lee等研究顯示，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)開始后24小時(shí)，大腦出血和誘導(dǎo)糖尿病，齒狀回凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著降低[13]。另外，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著增強(qiáng)高血糖大鼠齒狀回細(xì)胞的增殖。

6 結(jié)論

研究結(jié)果表明，規(guī)律的運(yùn)動(dòng)能減少糖尿病誘導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡率。降低周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，預(yù)防學(xué)習(xí)和記憶損害，防止老年癡呆的發(fā)生。

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THE EFFECT OF EXERCISE ON THE OXIDATIVE STRESS OF THE DIABETES-INDUCED RAT-HIPPOCAMPUS

LI Jing
（School of Physical Education，Chaohu College，Chaohu Anhui 238000）

Background∶Oxidative stress forms the foundation for the induction of multiple cellular pathways which can lead to the complications of diabetes mellitus.The most debilitating ones are diseases of the nervous system.In this study，whether treadmill running could alleviate the oxidative stress and cellular apoptosis rate in the hippocampus of streptozotocin-induced diabetic rats is evaluated.Methods∶Forty male Wistar rats were randomly divided into four groups(n=10)∶Control group，exercised group，diabetic group and diabetic-exercised group.Diabetes was induced by injection of streptozotocin in male rats.All rats in the trained group run on a rodent motor-driven treadmill for eight weeks.At the end of eight weeks，hippocampi of animals were immediately removed on ice and kept frozen.The light supernatant was taken and stored at-80°C.They were used for determination of antioxidant enzymes and TBARs level.Index of apoptosis was detected by cell death detection ELISA Kit.Results∶Levels of TBARs in diabetic group and diabetic-exercised group were significantly higher than control group.SOD and GPx activities significantly increased in exercised group and decreased in diabetic group.CAT activity significantly decreased in diabetic group versus control group.The apoptosis rate significantly increased and decreased in diabetic group and exercised group respectively compared to control group.Conclusion∶exercise has beneficial effects in the diabetic exercised rats，possibly in part because of alterations in the ability to adapt to exercise-induced oxidative stress.

oxidative stress；diabetes；treadmill exercise；apoptosis；hippocampus

G80

A

1672-2868（2015）06-0100-06

責(zé)任編輯：楊松水

2015-06-25

李靖(1982-），男，安徽巢湖人。巢湖學(xué)院體育學(xué)院，講師。研究方向：運(yùn)動(dòng)生理學(xué)。