江蘇地區(qū)肺癌和胃癌患者KRAS基因突變狀態(tài)分析*

謝玲 鄭燕影 孫怡 陳劼 申龍樹

·臨床研究與應(yīng)用·

江蘇地區(qū)肺癌和胃癌患者KRAS基因突變狀態(tài)分析*

謝玲 鄭燕影 孫怡 陳劼 申龍樹

目的：檢測江蘇地區(qū)肺癌和胃癌患者KRAS基因突變狀態(tài)及其與臨床病理特征的關(guān)系，并比較其在兩種癌癥間的異同。方法：收集肺癌128例，胃癌115例。采用直接測序法檢測KRAS基因第2號外顯子突變，分析基因突變狀態(tài)及其與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：KRAS基因突變率在肺癌和胃癌中無顯著性差異（6.3%vs.4.3%，P>0.05）。兩種癌癥中，KRAS基因突變都以第12密碼子為主。KRAS突變與年齡，性別無明顯相關(guān)。肺腺癌患者KRAS基因突變高于非腺癌包括鱗癌等（10.7%vs.0，P<0.05）。結(jié)論：江蘇地區(qū)肺癌和胃癌患者中，KRAS第2外顯子突變率均較低，男性和女性的突變率無明顯差異。肺腺癌患者KRAS基因突變率相對較高，因此個體化治療前應(yīng)同時檢測KRAS基因，以篩選出對靶向治療耐藥的肺癌患者，從而更好地指導(dǎo)患者的個體化分子靶向治療。

KRAS基因 肺癌 胃癌

根據(jù)GLOBOCAN公布的全球癌癥發(fā)病數(shù)據(jù)，2012年全球約有1 410萬新發(fā)癌癥病例，820萬患者死于癌癥。世界范圍內(nèi)發(fā)病最常見癌癥依次為肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌；死亡率最高為肺癌、肝癌和胃癌［1］。在我國肺癌和胃癌極為常見，是發(fā)病率很高的惡性腫瘤。肺癌是目前全世界發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占80%～85%［2］。胃癌在我國癌癥發(fā)病率和死亡率中均位列第3位［3］。

RAS基因是第一個被鑒定的人類原癌基因，RAS基因突變是最常見的癌基因異常，大約可見于30%的人體腫瘤。其家族的3個主要成員是HRAS、KRAS和NRAS，其中KRAS基因突變最常見［4］。KRAS基因是EGFR信號通路下游的重要癌基因，在細胞生長及血管生成等相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵作用。野生型KRAS基因在上游EGFR信號刺激下通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用，當(dāng)KRAS基因發(fā)生突變時，可不依賴其上游的EGFR發(fā)生自身磷酸化而持續(xù)處于激活狀態(tài)，這種激活是不可控的，并導(dǎo)致腫瘤的增殖和播散。因此突變型KRAS基因患者使用抗EGFR藥物治療無效［5-8］。KRAS基因最常見突變發(fā)生在第2號外顯子的第12和13位密碼子（85%～95%），其他突變位點包括第3號外顯子的第61和146位密碼子（約5%），檢測這些突變有重要的診斷及治療意義。美國NCCN臨床實踐指南明確指出：RAS基因發(fā)生突變的癌癥患者不建議使用分子靶向藥物如西妥昔單抗、吉非替尼治療等。本研究用測序法檢測肺癌和胃癌中KRAS基因第2外顯子的突變發(fā)生率、突變特征及其與臨床病理特征的關(guān)系，并比較基因突變在兩種癌癥間的異同。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

收集2006年12月至2014年12月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科及外院會診肺癌病例128例，胃癌115例。128例肺癌病例中，男性76例、女性52例，男女比例為1.5∶1；年齡為29～86歲，平均年齡為60.2歲。其中19例患者25～44歲，45例患者45～59歲，64例患者60～90歲。組織學(xué)證實腺癌75例，鱗癌30例，其他類型肺癌23例。115例胃癌病例中男性76例、女性39例，男女比例為1.9∶1。年齡為24～89歲，平均年齡61.1歲。其中13例患者25～44歲，43例患者45～59歲，59例患者60～90歲。組織學(xué)證實腸型胃癌90例，彌漫型胃癌25例。所有標(biāo)本均為甲醛固定、石蠟包埋組織，所有病例均行KRAS基因第2號外顯子突變檢測。本項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA抽提 所有蠟塊常規(guī)切片4 μm厚5～10張，顯微鏡下觀察HE切片，選取富于腫瘤細胞的區(qū)域，對應(yīng)H&E切片將腫瘤組織刮入裂解液，保證腫瘤成分50%以上。按照組織DNA提取試劑盒（美國OMEGA）說明書操作提取組織DNA。

1.2.2 PCR法擴增KRAS基因第2號外顯子 根據(jù)NCBI提供的KRAS基因DNA序列設(shè)計PCR引物，并由上海生工公司合成。序列如下：上游引物為AGG CCTGCTGAAAATGACTG；下游引物為：CATGAAAA TGGTCAGAGAAACC。PCR反應(yīng)體系20 μL：10×PCR Buffer2μL，HotStar Taq DNA Polymerase（德國QIAGE公司）0.2 μL，Mg2+-Solution 0.75 μL，dNTP 2 μL，Primer各1 μL，模板DNA 1 μL，去離子水12 μL。PCR反應(yīng)條件：置ABI-9700型擴增儀中，95℃預(yù)變性15 min， 94℃變性50 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后于72℃延伸10 min。以雙蒸水代替DNA模板作為陰性對照，以已知陽性病例作為陽性對照。

1.2.3 DNA測序 將PCR產(chǎn)物進行過柱純化（美國Axygen公司），然后用PCR純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)及純化后，上樣至ABI 3100-Avant遺傳分析儀進行測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，對不同組別的突變率行χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者KRAS基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性

肺癌患者KRAS基因突變率為6.3%（8/128），其中6例為第12密碼子突變，占75%（6/8）；2例為第13密碼子突變，占25%（2/8）。第12密碼子中G12D（GGT>GAT）4例，G12V（GGT>GTT）1例，G12C（GGT> TGT）1例；第13密碼子中G13D（GGC>GAC）2例。KRAS基因突變類型及其與病理類型、性別、年齡的關(guān)系見表1。128例肺癌中，肺腺癌患者KRAS基因突變?yōu)?0.7%（8/75），高于非腺癌患者包括鱗癌等（P<0.05）。肺癌男性患者KRAS突變率為6.6%（5/ 76），略高于女性患者5.7%（3/52），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。KRAS基因在25～44歲患者中突變率為10.5%（2/19），高于45～59歲患者的6.7%（3/45）及60～90歲患者的4.7%（3/64），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 胃癌患者KRAS基因突變特征及其與臨床病理的相關(guān)性

胃癌患者KRAS基因突變率為4.3%（5/115），其中4例為第12密碼子突變，占80%（4/5）；1例為第13密碼子突變，占20%（1/5）。第12密碼子中G12D（GGT>GAT）3例，G12V（GGT>GTT）1例；第13密碼子中G13D（GGC>GAC）1例。KRAS基因突變類型及其與病理類型、性別、年齡的關(guān)系見表2。115例胃癌中，彌漫型胃癌KRAS基因突變率為8.0%（2/25），高于腸型胃癌的3.3%（3/90），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。胃癌患者男性和女性KRAS突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。KRAS基因在25～44歲患者中突變率為7.7%（1/13），高于45～59歲的4.6%（2/43）及60～90歲患者的3.4%（2/59），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 128例肺癌中KRAS基因突變類型分布及其與性別、年齡、病理類型的關(guān)系Table 1 Mutation frequencies of KRAS gene and their relationship with pathological types,gender,and age of lung cancer patients

表2 115例胃癌中KRAS基因突變類型分布及其與性別、年齡、病理類型的關(guān)系Table 2 Mutation frequencies of KRAS gene and their relationship with pathological types,gender,and age of gastric cancer patients

3 討論

分子靶向藥物的研發(fā)和個體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展使腫瘤治療進入了分子靶向治療的新時期。目前，靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）已廣泛應(yīng)用于臨床治療NSCLC。研究表明，EGFR基因突變與TKIs敏感性相關(guān)，編碼EGFR下游GTP酶的KRAS基因突變則是NSCLC患者耐藥的主要原因［5-7］。KRAS基因的突變可以引起EGFR信號通路的配體非依賴性持續(xù)性激活，進而導(dǎo)致EGFR-TKI原發(fā)性耐藥。因此檢測KRAS基因突變可能有助于選擇最適宜患者接受TKI治療，也是判斷NSCLC患者預(yù)后的一項重要指標(biāo)?？笶GFR單克隆抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗等）用于靶向治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌者。RAS基因突變的結(jié)直腸癌患者不能從抗EGFR治療中獲益，反而徒增不良反應(yīng)危險和治療費用，而KRAS基因野生型患者就很有可能從這類藥物治療中獲益［8-9］。遺憾的是，應(yīng)用EGFR分子靶向藥物治療胃癌的情形可能有別于結(jié)腸癌和肺癌，相關(guān)的臨床研究不多，針對胃癌KRAS基因突變與EGFR分子靶向藥物療效的研究也較少。有研究表明，西妥昔單抗聯(lián)合化療治療晚期胃癌有良好的療效［10］。一項聯(lián)合應(yīng)用西妥昔單抗與FOLFIRI方案的近期研究發(fā)現(xiàn)，KRAS野生型，EGFR陽性表達的胃癌細胞株對西妥昔單抗治療敏感［11］。

西方國家NSCLC患者人群中KRAS基因突變率較高，非小細胞肺癌突變率為20%～30%，其中腺癌的突變率為22%～34%，鱗癌為0～25%，大細胞肺癌為8%～33%，腺鱗癌為8%～11%，但EGFR基因的突變率低，僅為3%～8%；亞洲國家NSCLC患者則相反，EGFR基因的突變率為30%～60%，KRAS基因的突變率為4%～24%［12-15］。KRAS基因突變在非亞洲人群、吸煙者以及黏液性腺癌中最為常見。NSCLC患者KRAS基因突變主要發(fā)生于第2外顯子的12和13號密碼子，其中第12密碼子的突變?yōu)?0%～96%，第13密碼子的突變?yōu)?%～12%［15］。本研究中，檢測了128例肺癌病例中KRAS基因第2號外顯子突變，突變率為6.3%（8/128）。這與先前報道的白種人腺癌患者KRAS基因較高突變率明顯不相符合，但卻與亞裔患者KRAS基因突變率相近。造成這種差異的原因很可能與種族相關(guān)，對此尚需要進一步研究證實。本研究結(jié)果顯示，KRAS基因突變類型主要為G12D（GGT>GAT），突變率均為3.1%（4/128）；在8例KRAS基因突變病例中，主要為12密碼子突變，共有6例（75%），另外2例為13密碼子突變（25%），與相關(guān)文獻報道結(jié)果一致。據(jù)報道，男性患者KRAS基因突變率比女性明顯高，腺癌患者比鱗癌患者顯著增高［16］。本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者的突變率明顯高于非腺癌患者包括鱗癌等（P<0.05），男性患者的KRAS基因突變率略高于女性，25～44歲患者突變率高于45～59歲及60～90歲患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

RAS基因突變與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在胃腺癌中KRAS基因突變率為0～28%，并且不同地區(qū)有著不同的發(fā)生率，日本為0～13%，韓國為2.8～9.0%，意大利為8～21%，美國、荷蘭等地區(qū)的發(fā)生率均不足4%［17］。我國胃癌KRAS基因突變率為0～10.3%［18］。本研究結(jié)果為4.3%（5/115），在5例KRAS基因突變病例中，主要為第12密碼子突變，共有4例（80%），另外1例為第13密碼子突變（20%），與亞洲地區(qū)結(jié)果類似。根據(jù)文獻報道，KRAS基因突變與HP感染，胃癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，腸型胃癌中KRAS基因突變發(fā)生率高于彌漫型胃癌。但本結(jié)果顯示彌漫型胃癌KRAS基因突變率為8.0%（2/25），高于腸型胃癌的3.3%（3/90），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。由于彌漫型胃癌有較高的KRAS基因突變率，該基因突變對其個體化治療有無價值，值得做更進一步的研究。鑒于本研究病例數(shù)量較少，未來尚需要擴大病例數(shù)進行研究。有關(guān)胃癌組織中KRAS基因狀態(tài)研究較少，但已有的研究表明，總體突變率不高，其對EGFR靶向治療胃癌的影響仍有待闡明，需要進一步的研究以尋找更有效的生物標(biāo)記物。

本研究中，KRAS基因突變率在肺癌和胃癌中均較低，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。文獻報道腸癌患者KRAS基因突變率為30%～40%，明顯高于肺癌和胃癌患者［19］。目前，腫瘤組織RAS基因突變作為西妥昔單抗在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中療效的預(yù)測指標(biāo)已經(jīng)成為共識。雖然亞洲人群肺癌患者KRAS基因突變率較低，但是肺腺癌患者突變率明顯高于非腺癌患者，因此臨床肺腺癌患者在應(yīng)用靶向藥物之前也應(yīng)重視KRAS基因突變的檢測，從而更好地指導(dǎo)患者的個體化分子靶向治療。肺癌和胃癌二種腫瘤中，KRAS基因突變都以第 12密碼子為主，并未見KRAS突變與年齡、性別相關(guān)，KRAS基因突變與臨床病理特征之間的關(guān)系尚需更多的研究來確定。

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（2015-07-07收稿）

（2015-09-24修回）

（編輯：楊紅欣）

KRAS gene mutations in lung and gastric cancers in Jiangsu Province

Ling XIE,Yanying ZHENG,Yi SUN,Jie CHEN,Longshu SHEN

Department of Pathology,TheAffiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China This work was supported by the Funds of Disciplinary Building-up Project of High Scholarship and Creative Research Potential in Jiangsu Colleges and Universities(No.01206 2003010).

Objective:To investigate the KRAS gene mutation features in lung and gastric cancers and their relationship with clinicopathologic characteristics.Methods:A total of 128 lung cancer and 115 gastric cancer patients were included.Polymerase chain reaction amplification and DNA sequencing were conducted to detect mutations in exon 2 of the KRAS gene.Results:The mutation frequency of KRAS was different in lung and gastric cancers;however,it did not show any statistical significance(6.3%vs.4.3%,P> 0.05).The KRAS codon 12 gene mutation ranks the first in both types of cancer.No significant correlation was observed between the prevalence of KRAS mutations and patient's age and gender.KRAS gene mutation rate was higher in lung adenocarcinoma than in nonadenocarcinoma,such as squamous cancer(10.7%vs.0%,P<0.05).Conclusion:No correlation was found between the KRAS gene mutation and the sex and age of lung and gastric cancer patients in Jiangsu Province.The rate of KRAS mutation was low.KRAS gene mutation rate was relatively higher in lung adenocarcinoma patients;thus,the mutation status of the KRAS gene should be evaluated before undergoing EGFR-TKI therapy.

KRAS gene,lung cancer,gastric cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.21.736

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科（南京市210029）

*本文課題受江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程基金項目（編號：012062003010）資助

申龍樹 11559696@qq.com

謝玲 專業(yè)方向為臨床腫瘤病理及分子病理學(xué)研究。

E-mail：xl6250@163.com