基于UPLC／Q－TOF MS技術(shù)的白術(shù)藥材化學成分快速識別研究

鐘艷梅，馮毅凡，郭 姣

（1．廣東藥學院中心實驗室，廣東廣州 510006；2．國家中醫(yī)藥管理局高脂血癥“調(diào)肝降脂”重點研究室，國家中醫(yī)藥管理局“脂代謝”三級實驗室，廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，廣東廣州 510006）

基于UPLC／Q－TOF MS技術(shù)的白術(shù)藥材化學成分快速識別研究

鐘艷梅1，馮毅凡1，郭 姣2

（1．廣東藥學院中心實驗室，廣東廣州 510006；2．國家中醫(yī)藥管理局高脂血癥“調(diào)肝降脂”重點研究室，國家中醫(yī)藥管理局“脂代謝”三級實驗室，廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，廣東廣州 510006）

建立了超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC／Q－TOF MS）法快速鑒定白術(shù)生藥材中的多種化學成分。采用Aquity UPLC／Q－TOF micro聯(lián)用儀，以水－乙腈流動相梯度洗脫，ESI＋模式采集數(shù)據(jù)，Masslynx4．1軟件分析處理數(shù)據(jù)。實驗分析了白術(shù)藥材中的24個峰信號，鑒定了其中的20種化學成分。結(jié)果表明，應用UPLC／Q－TOF MS技術(shù)能夠快速鑒定白術(shù)藥材的化學成分，是中藥成分分析的有效手段。

超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC／Q－TOF MS）；化學成分；白術(shù)

白術(shù)為菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz）的根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功效，主治脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲水腫、自汗、胎動不安等癥，為最常用的中醫(yī)補脾要藥［1－3］?，F(xiàn)代研究表明，白術(shù)具有提高抗病能力、利尿、降血糖、抗腫瘤、抗炎等藥理作用［4－5］。深入研究白術(shù)藥材的化學成分對揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有現(xiàn)實意義。目前，對白術(shù)的分析報道主要集中在揮發(fā)油，多糖等研究方面［2，4－6］，而對物質(zhì)基礎(chǔ)化學成分的研究并不全面，阻礙了對其藥理作用的深入研究。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的有力手段，相較于傳統(tǒng)的硅膠柱層析法，高效液相色譜（HPLC）法具有操作簡單、信息量大、節(jié)省溶劑等優(yōu)點，通過色譜－中藥藥材的全成分快速掃描鑒定，可以有效避免中藥化學成分的重復分離鑒定及對一些易遺漏成分的識別。

超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC／Q－TOF MS）具有分辨率高、靈敏度高、選擇性高、用時短、掃描范圍廣等特點，能夠給出相對誤差小于5×10－6的精確分子質(zhì)量信息和二級特征裂解碎片離子信息。本研究擬采用UPLC／Q－TOF MS法對白術(shù)生藥材供試品進行全成分掃描與快速鑒定，以期為中藥成分的分析提供方法參考。

1 實驗部分

1．1 主要儀器與裝置

Acquity超高效液相色譜分析系統(tǒng)，Q－TOF micro高分辨四極桿與飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有l(wèi)ock－spray接口），Masslynx4．1數(shù)據(jù)軟件處理系統(tǒng)，Acuqity UPLCTMBEH C18色譜柱（2．1m×50mm×1．7μm）：美國Waters公司產(chǎn)品；DL－360A超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司產(chǎn)品；超低有機物型Arium 611UV超純水器：德國Sartorius公司產(chǎn)品。

1．2 主要材料與試劑

白術(shù)生藥材（產(chǎn)地安徽）：購自安徽亳州市中藥飲片廠，經(jīng)廣東藥學院中藥學院劉基柱副教授鑒定為菊科植物白術(shù)（Atractxlodes macrocephala Koidz）的根莖Atractylodis macrocephalae Rhizoma，藥材標本保存于廣東藥學院中心實驗室；乙腈（UPLC級），甲醇（HPLC級）：德國Merck公司產(chǎn)品；Lockmass腦啡肽（批號L9133－50MG，純度≥95％）：美國Sigma公司產(chǎn)品。

樣品及標準品的制備：稱取10．0g白術(shù)藥材提取物，用20mL 70％甲醇浸泡過夜，超聲提取2h，過濾，濾液過0．22μm微孔濾膜，待分析。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號110803），白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號110826）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號110904）：購自天津一方科技有限公司，純度≥98％。標準品溶液的制備：分別精密稱取1mg上述對照品粉末于10mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，過0．22μm微孔濾膜，待分析。

1．3 實驗條件

1．3．1 色譜條件 Acquity UPLCTMBEH C18色譜柱（2．1m×50mm×1．7μm）；二元梯度洗脫，流動相A為水溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件：0～3min、98～75％A，3～10min、75～68％A，10～13min、68％A，13～17min、65～50％A，17～22min、50～45％A，22～25min、45％A，25～30min、45～30％A，30～35min、30～0％A，35～40min、0～98％A；流速0．4mL／min；進樣量5μL；柱溫30℃。

1．3．2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式（ESI＋），毛細管電壓3 000V，錐孔電壓30V，離子源溫度120℃，脫溶劑溫度350℃，碰撞能量10V，脫溶劑氮氣流速500L／h，錐孔反吹氮氣流速50L／h，脫溶劑氣為氮氣，碰撞氣體為氬氣。采用Lock mass通路對實驗數(shù)據(jù)進行采集并實時校正，Lock mass標準品溶液為腦腓肽（10mg／L），校正切換頻率為10次／s，掃描范圍為m／z50～1 400。

1．4 方法學考察

1．4．1 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次進樣5μL，各主要色譜

峰的保留時間RSD值均小于0．3％，相對峰面積的RSD值均小于3％，說明儀器的精密度良好。

1．4．2 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、12、24h進樣檢測，每次進樣5μL，各主要色譜峰的保留時間RSD值均小于0．3％，相對峰面積的RSD值均小于3％，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

1．4．3 重現(xiàn)性實驗 分別將制備的6份供試品進樣檢測，每次進樣5μL，各主要峰的保留時間RSD值均小于0．3％，相對峰面積的RSD值均小于3％，表明實驗方法的重復性良好。

2 結(jié)果與討論

白術(shù)藥材樣品在ESI＋模式下獲得了良好的響應值，其總離子流圖示于圖1。在40min內(nèi)，樣品中的化學成分得到了良好的分離，共識別鑒定了24個峰信號，采用Masslynx4．1軟件分析處理數(shù)據(jù)，鑒定了包括白術(shù)內(nèi)酯類、生物堿類、倍半萜類、糖苷、有機酸及其他類成分共20種，示于圖2。其中9種成分為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)，需進一步分離單體后驗證，其Q－TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析及鑒定結(jié)果列于表1。

實驗中，Masslynx工作站給出的ESI－MS高分辨數(shù)據(jù)可以得到誤差小于5×10－6的元素組成，應用氮率等質(zhì)譜規(guī)律可以得出化合物的分子式和高分辨分子質(zhì)量。在ESI－MS／MS圖譜中，通過選擇合適的碰撞能量，可以得到每個目標分子離子的特征二級碎片離子及其在二級質(zhì)譜圖中的相對強度；由高分辨分子質(zhì)量，分子式和特征二級碎片離子等信息，可以推測得到物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)信息；同時，采用標準品比對，通過Scifinder、Chemspider等數(shù)據(jù)庫檢索，可以快速鑒定白術(shù)生藥材供試品中的化合物。

以峰6為例說明鑒定過程。峰6的一級質(zhì)譜圖與二級質(zhì)譜圖示于圖3。峰6的高分辨ESI－MS為m／z231．141 7，Masslynx工作站給出的元素組成為C15H21O2，根據(jù)氮率認為是檢測離子［M＋H］＋峰，其分子式為C15H20O2，這與文獻報道［5－6］的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的數(shù)據(jù)吻合。其二級質(zhì)譜的主要特征碎片為m／z 231［M＋H］＋、m／z217［M＋H－CH3］＋、m／z204［M＋H－2CH3］＋、189［M＋H－2CH3－CH2］＋，推斷峰6為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標準品與白術(shù)藥材的總離子流圖示于圖4。由圖4可見，峰6的保留行為及質(zhì)譜數(shù)據(jù)與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標準品一致，由此可判定峰6為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。

實驗發(fā)現(xiàn)，白術(shù)的化學成分較復雜，不同類別的物質(zhì)在ESI－MS／MS中的裂解行為不同。在正離子模式下，內(nèi)酯類、內(nèi)酰胺類、生物堿類成分的響應較強烈，本實驗最終鑒定了包括白術(shù)內(nèi)酯、糖苷、生物堿等20種化合物。從圖1可以看出，以色譜峰峰面積計算，峰4（白術(shù)內(nèi)酰胺）、峰11（白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）、峰18（倍半萜類物質(zhì)）、峰23（蒼術(shù)酮）的響應較強，是在正離子模式下檢測到的主要成分，可能與白術(shù)藥材的藥效相關(guān)。

圖1 正離子模式下，白術(shù)生藥材供試品UPLC／Q－TOF MS的總離子流圖Fig．1 Total ions chromatogram of Atractxlodes macrocephala Koidz by UPLC／Q－TOF MS in positive ion mode

圖2 基于UPLC／Q－TOF MS技術(shù)鑒定的白術(shù)藥材供試品溶液中化學成分峰1～24Fig．2 The components peak 1－24 fromAtractxlodes macrocephala Koidz by UPLC／Q－TOF MS

表1 白術(shù)藥材供試品溶液中化學成分的Q－TOF串聯(lián)質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 The identification result of components fromAtractxlodes macrocephala Koidz by Q－TOF

圖3 峰6的一級質(zhì)譜（a）與二級質(zhì)譜（b）圖Fig．3 MS（a）and MS／MS（b）spectrum of peak 6

圖4 標準品白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（a）與白術(shù)藥材（b）的總離子流圖Fig．4 Total ions chromatograms of the standard AtractylenolideⅠ（a）and Atractxlodes macrocephala Koidz（b）by UPLC－Q－TOF MS in positive ion mode

3 結(jié)論

本研究采用UPLC／Q－TOF MS技術(shù)快速鑒定了白術(shù)生藥材中的20種化學成分，主要包括白術(shù)內(nèi)酯類、生物堿類、糖苷和有機酸等，實驗結(jié)果可為進一步研究白術(shù)藥用物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。實驗表明，UPLC／Q－TOF MS技術(shù)在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)化學成分鑒定研究中具有較好的定性分離作用，是中藥成分分析的有效手段。

［1］ 楊翠平，勞業(yè)興，吳鳳薇，等．白術(shù)的研究進展［J］．中藥材，2002，25（3）：206－208．YANG Cuiping，LAO Yexing，WU Fengwei，et al． Advance of Atractylodes macrocephala Koidz［J］．Journal of Chinese Medicinal Materials，2002，25（3）：206－208（in Chinese）．

［2］ 楊娥，鐘艷梅，馮毅凡．白術(shù)化學成分和藥理作用的研究進展［J］．廣東藥學院學報，2012，28（2）：218－221．YANG E，ZHONG Yanmei，F(xiàn)ENG Yifan．Advance on the chemical constituents and pharmacological effects of Atractylodes macrocephala Koidz［J］．Journal of Guangdong Pharmaceutical University，2012，28（2）：218－221（in Chinese）．

［3］ 劉勝姿，魏萬之，邱細敏，等．白術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)酮不同提取方法的薄層對比［J］．湖南中醫(yī)學院學報，2004，24（4）：29－30．

LIU Shengzi，WEI Wanzhi，QIU Ximin，et al．Comparison of different extraction method of thin layer of atractylone in volatile oil of Rhizoma Atractylodis Macrocephalae［J］．Journal of Hunan University of Chinese Medicine，2004，24（4）：29－30（in Chinese）．

［4］ 言麗娜．蒼術(shù)、白術(shù)中有效成分研究及中藥材元素指紋圖譜的建立［D］．長沙：湖南師范大學，2008．

［5］ 沈國慶．白術(shù)化學成分及抗腫瘤部位活性研究［D］．北京：北京中醫(yī)藥大學，2008．

［6］ 黃海英．白術(shù)活性成分的提取、純化及功能性研究［D］．南昌：南昌大學生命科學學院，2006．

［7］ 李偉．白術(shù)的有效物質(zhì)及質(zhì)量研究［D］．南京：南京中醫(yī)藥大學，2001．

［8］ KITSJIMA J，KAMOSHITA A，ISHIKAWA T，et al．Glycosides of Atractylodes ovata［J］．Chem Pharm Bull，2003，51（9）：1 106－1 108．

［9］ MISHCHENKO N P，MAXIMOV O B，KRIVOS－HCHEKOVA O E，et al．Depsidones and fatty acids of Parmelia stygia［J］．Phytochemistry，1984，23（1）：180－181．

［10］BALABAN M．Identification of the main phenolic compounds in wood of Ceratonia siliqua by GC－MS［J］．Phytochemical Analysis，2004，15（6）：385－388．

［11］HUANG L F，LIANG Y Z，GUO F Q，et al．Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militarris by LC／ESI－MS［J］．J Pharm Biomed Anal，2003，33（5）：1 155－1 162．

［12］ZHANG Q F，LUO S D，WANG H Y．Two new sesquiterpenessfrom Atraetylodes maerocephala［J］．Chin Chem Lett，1998，9（12）：1 097－1 100．

［13］李偉，文紅梅，崔小兵，等．白術(shù)的化學成分研究［J］．中草藥，2007，38（10）：1 460－1 462．LI Wei，WEN Hongmei，CUI Xiaobing，et al．Chemical constituentsin rhizome of Atractylodes macrocephala［J］．Chin Tradit Herbal Drugs，2007，38（10）：1 460－1 462（in Chinese）．

［14］KITAJIMA J，KAMOSHITA A，ISHIKAWA T，et al．Glyeosides of Atractylodes ovata［J］．Chem Pharm Bull，2003，51（9）：1 106－1 108．

［15］LIN Y，JIN T，WU X，et al．A novel Bisesquiterpenoid，Blatraetylolide，from the Chinese herbal plant Atraetylodes macrocephala［J］．J Nat Prod，1997，60（1）：27－28．

［16］林永成，金濤，袁至美，等．中藥白術(shù)中一種新的雙倍半萜內(nèi)醋［J］．中山大學學報：自然科學版，1995，35（2）：75．LIN Yongcheng，JIN Tao，YUAN Zhimei，et al．A unique bisesquiterpenoid from the Chinese herb medicine Atraetylodes macrocephala［J］．Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni，1995，35（2）：75（in Chinese）．

［17］ZHANG Q，LUO S，WANG H．Two new sesquiterpenessfromAtraetylodes maeroce pala［J］．Chin Chem Lett，1998，9（12）：1 097－1 100．

［18］CHEN Z，CAO W，ZHOU G，et al．A sesquiterpene lactam from Atractylodes macroce phala［J］．Photochem Photobiol，1997，45（4）：765－767．

［19］吳素香，呂圭源，李萬里，等．白術(shù)超臨界CO2萃取工藝及萃取物的化學成分研究［J］．中成藥，2005，27（8）：885－887．WU Suxiang，LV Guiyuan，LI Wanli，et al．The SFE－CO2technologic study and the research of the chemical composition from SFE－CO2extract of Atractylodes macroce phala［J］．Chin Tradit Pat Med，2005，27（8）：885－887（in Chinese）．

Rapid Identification of Components fromAtractylodis macrocephalae Rhizoma Based on UPLC／Q－TOF MS

ZHONG Yan－mei1，F(xiàn)ENG Yi－fan1，GUO Jiao2
（1．Central Laboratory，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou510006，China；2．Key Unit of Modulating Liver to Treat Hyperlipemia SATCM，Level 3 Laboratory of Lipid Metabolism SATCM，Guangdong TCM Key Laboratory for Metabolic Diseases，Guangzhou510006，China）

The components of Atractylodis macrocephalae Rhizoma were identified by ultra－h(huán)igh performance liquid chromatography with tandem quadrupole time－of－flight mass spectrometry（UPLC／Q－TOF MS）．Using Aquity UPLC／Q－TOF micro system gradient elute with water－acetonitrile mobile phase under positive mode of ESI；data were analyzed by Masslynx4．1software．Twenty－four peaks in chromatogram of Atractylodis macrocephalae Rhizoma were analyzed，and 20kinds of components were identified．Rapid identification of components fromAtractylodis macrocephalae Rhizoma was

UPLC－Q－TOF MS；components；Atractylodis macrocephalae Rhizoma

O 657．63；R 284．1

A

1004－2997（2015）01－0072－06

10．7538／zpxb．youxian．2014．0058

2014－02－28；

2014－06－23

廣東省自然科學基金團隊項目（10351022401000000）；廣東省教育部產(chǎn)學研結(jié)合項目（2011B090400379）資助

鐘艷梅（1983—），女（漢族），陜西人，助理研究員，從事現(xiàn)代儀器在藥物分析中的應用研究。

E－mail：yanmei＿zhong＠gdpu．edu．cn

郭 姣（1961—），女（漢族），江西人，教授，從事高脂血癥的理論、臨床、作用機理和物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其中藥新藥研發(fā)。E－mail：guoj＠gdpu．edu．cn

時間：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0058．html

carried out by UPLC／Q－TOF MS，which will be an effective device in analysis of compositions research in traditional Chinese medicine．