液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定煙草中6種Amadori化合物

賈春曉，修龍飛，牟定榮，毛多斌

（1．鄭州輕工業(yè)學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2．鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002；3．紅塔煙草（集團）有限公司技術(shù)中心，云南玉溪 653100）

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定煙草中6種Amadori化合物

賈春曉1，修龍飛2，牟定榮3，毛多斌2

（1．鄭州輕工業(yè)學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2．鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002；3．紅塔煙草（集團）有限公司技術(shù)中心，云南玉溪 653100）

建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定煙草中6種Amadori化合物的定性和定量分析方法。試樣以70％甲醇水溶液為萃取劑，經(jīng)過正交實驗優(yōu)化后的超聲萃取條件為：料液比1∶30、萃取功率120W，萃取時間25min。所得萃取液用正己烷洗滌除去雜質(zhì)后，在選擇反應(yīng)監(jiān)測模式下進行液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜定性及定量分析，其中Amadori化合物采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。結(jié)果表明：所測定的6種Amadori化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0．995 0。方法的檢出限（LOD）為20．06～39．86μg／kg，定量限（LOQ）為66．85～132．9μg／kg，平均回收率在86．56％～88．86％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5％。該方法簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于煙草中Amadori化合物的定性和定量分析。

煙草；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）；Amadori化合物

Amadori化合物是由還原糖和氨基酸經(jīng)縮合、脫水、Amadori重排而得到的一類Mainland反應(yīng)中間產(chǎn)物，即1－氨基－1－脫氧－2－酮糖［1］，它是煙草中一種重要的香味前體物質(zhì)［2］。Amadori化合物在通常狀態(tài)下沒有氣味，但在卷煙燃吸過程中，能夠裂解釋放出對卷煙香氣具有重要貢獻的香味物質(zhì)，如吡嗪類、呋喃類以及吡咯類化合物等［3－4］。因此，研究其萃取條件和分析其在煙草中的含量，對評價煙草的內(nèi)在質(zhì)量及提高卷煙香氣具有重要的指導(dǎo)意義。

Amadori化合物極性強、種類多、結(jié)構(gòu)類似，對其進行定性定量分析難度較大［5］。目前，國內(nèi)外對于Amadori化合物的分析主要采用氣相色譜（GC）法［6］、高效液相色譜（HPLC）法［7－9］、高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC／MS）法［10］、離子交換色譜（IEC）法和離子交換色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（IEC－MS／MS）法［11－13］等，其中，HPLC／MS和IEC－MS／MS法是目前最有效的定性分析方法。然而，由于沒有市售標(biāo)準(zhǔn)品，采用標(biāo)準(zhǔn)樣品同時進行Amadori化合物的定量分析研究鮮有報道。

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）具有快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點［14－15］。本研究擬采用超聲波輔助萃取，并通過正交實驗優(yōu)化前處理條件，在此基礎(chǔ)上采用LC－MS／MS技術(shù)，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)樣品，對煙草中的Amadori化合物進行定性鑒定；另外，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對煙草中的6種Amadori化合物進行定量測定。

1 實驗部分

1．1 儀器

LTQ XL型液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur 2．2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；KQ－5200DB型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ－D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵：鄭州市中原科技儀器廠產(chǎn)品；AB265－S型分析天平（感量0．000 01g）：瑞士Mettler公司產(chǎn)品；RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；Mili－Q超純水儀：美國Milipore公司產(chǎn)品。

1．2 主要材料與試劑

甘氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru－Gly）、丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru－Ala）、脯氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru－Pro）、蘇氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru－Thr）、谷氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru－Glu）、α－氨基丁酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru－Amb）標(biāo)準(zhǔn)對照品：本課題組用化學(xué)合成法自制，其結(jié)構(gòu)經(jīng)紅外光譜、核磁共振、多級質(zhì)譜及高分辨質(zhì)譜表征，純度均大于98％；實驗用水：Mili－Q超純水；甲醇（色譜純）、無水甲醇（分析純）：天津四友精細化工有限公司產(chǎn)品；正己烷（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲酸：美國Acros Organics公司產(chǎn)品。

1．3 煙葉樣品的前處理

各種煙葉樣品均由紅塔煙草集團提供。將煙葉樣品于30℃烘干粉碎，過60目篩。準(zhǔn)確稱取2．000g煙葉粉末，置于帶塞錐形瓶中，加入70％甲醇水溶液，在料液比1∶30，功率120W的條件下，超聲萃取20min；抽濾后，濾渣用70％甲醇水溶液洗滌3次（每次30mL），合并濾液和洗滌液，在減壓條件下于30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

濃縮至干；然后，用50mL 70％甲醇水溶液溶解，正己烷洗滌3次（每次30mL），以除去色素等雜質(zhì)；將洗滌后的甲醇－水相濃縮至干，再用70％甲醇水溶液定容至10mL，過0．45μm有機濾膜，待LC－MS／MS分析。

1．4 實驗條件

1．4．1 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil Gold（100mm×2．1mm×1．9μm）；流動相：甲醇－水（0．1％甲酸）溶液（50∶50，V／V）；等度洗脫；流速200μL／min；柱溫20℃；自動進樣，進樣量2μL。

1．4．2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM），離子源噴霧電壓5kV，毛細管電壓12V，透鏡電壓50V，毛細管溫度350℃，氣體（N2）壓力250kPa，質(zhì)量掃描范圍m／z 200～500。6種目標(biāo)化合物的定性和定量離子對及碰撞能量等參數(shù)列于表1。

表1 Amadori化合物質(zhì)譜檢測條件Table 1 MS／MS conditions for the detection of Amadori compounds

2 結(jié)果與討論

2．1 超聲萃取條件的優(yōu)化

2．1．1 單因素實驗 考察萃取條件時，以煙葉樣品中Amadori化合物的實際萃取量為指標(biāo)。因為萃取量與其峰面積成正比，所以用6種Amadori化合物的總峰面積的對數(shù)值代表其總萃取量，以煙葉中Amadori化合物的總萃取量為指標(biāo)，分別考察了萃取溶劑、所選溶劑濃度、料液比（煙葉樣品質(zhì)量與萃取溶劑體積之比，g／mL）、超聲功率和萃取時間對萃取量的影響。

由于Amadori化合物具有較大的極性，因此分別選用甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙腈為萃取溶劑，固定其他條件對煙葉樣品進行萃取。結(jié)果表明，甲醇的萃取效果最好。根據(jù)上述結(jié)果，又考察了不同濃度的甲醇水溶液（50％、60％、 70％、80％、90％）對萃取量的影響。結(jié)果表明，用70％甲醇水溶液作為萃取溶劑時，Amadori化合物的總萃取量最大。

以70％甲醇水溶液作為萃取溶劑，分別考察了不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），不同超聲功率（80、100、120、140、160W）以及不同萃取時間（10、15、20、25、30min）的萃取結(jié)果，示于圖1。由圖1可知，當(dāng)料液比為1∶30，超聲功率為120W，超聲時間為20min時，總萃取量達到最大值。

2．1．2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以料液比（A）、萃取功率（B）、萃取時間（C）為影響因素進行正交實驗，選用L9（34）正交實驗表安排實驗因素水平。正交實驗因素水平表及正交結(jié)果分別列于表2和表3。

圖1 料液比，超聲功率和萃取時間對萃取結(jié)果的影響Fig．1 The effect of solid－liquid ratio，ultrasonic power and extraction time vs extraction results

表2 正交實驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

由表3可知，極差R是各因素對Amaodri化合物萃取因素的影響程度，因素主次順序為A＞B＞C，即萃取料液比是影響提取效果的主要因素，其次為萃取功率，而萃取時間的影響最小。比較K1、K2、K3可知，Amadori化合物的最佳萃取條件為A2B2C3，即料液比1∶30、萃取功率120W、萃取時間25min。

2．2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments

Amadori化合物含有羧基和多個羥基，容易加和氫離子形成正電荷母離子［M＋1］＋，因此，選用正離子模式對Amadori化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行全掃描，以確定分子離子峰。然后優(yōu)化碰撞能量，使母離子進一步碎裂，并對其子離子進行全掃描。在此基礎(chǔ)上，選擇2個信噪比高、峰形好、干擾小的特征子離子作為定性離子對，并將響應(yīng)值最高的2個子離子作為定量離子對，采用SRM掃描模式，該方法鑒別點

（IPs）均能滿足歐盟2002／657／EC的決議要求［16］。所得6種Amadori化合物的SRM色譜圖示于圖2。

2．3 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

準(zhǔn)確稱取0．010 20g Fru－Gly、0．022 03g Fru－Ala、0．194 90g Fru－Pro、0．015 82g Fru－Thr、0．010 05g Fru－Glu，0．031 24g Fru－Amb，用70％甲醇水溶液溶解，定容至50mL容量瓶中，配制成混標(biāo)儲備液。分別用移液管移取0．10、1．0、3．0、5．0、7．0、9．0、10．0mL混標(biāo)儲備液于10mL容量瓶中，用70％甲醇水溶液定容，得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1．4節(jié)條件進行測定，分別以相應(yīng)的Amadori化合物離子峰面積y對濃度x擬合線性方程，相關(guān)系數(shù)r均大于0．995 0，各組分的線性方程、線性范圍、檢出限、定量限列于表4。

2．4 回收率和精密度實驗

準(zhǔn)確稱取2．000g煙葉樣品，按照1．3節(jié)方法進行處理，按1．4節(jié)條件進行分析，測定6種Amadori化合物的含量，平行測定5次，計算平均含量及RSD1，結(jié)果列于表5。

采用實際樣品添加標(biāo)樣的方法測定回收率。取2．000g煙葉樣品粉末，分別加入一定量的Amadori化合物標(biāo)樣，按1．3節(jié)和1．4節(jié)的方法進行處理與分析，并根據(jù)6種Amadori化合物的原含量、加標(biāo)量和測定量計算回收率和RSD2，結(jié)果列于表5。

2．5 實際樣品的測定

采用本方法對12個煙樣進行測定，平行測定3次，取峰面積的平均值，通過外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算相應(yīng)的Amadori化合物含量，結(jié)果列于表6。

圖2 六種Amadori化合物的SRM色譜圖Fig．2 SRM chromatogram of 6 kinds of Amadori compounds

表4 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantification

表5 回收率與精密度結(jié)果（n＝5）Table 5 Results of recovery and precision（n＝5）

表6 實際樣品測定Table 6 Determination of actual samples

3 結(jié)論

建立了LC－MS／MS同時測定煙草中6種Amadori化合物的定性和定量分析方法。優(yōu)化了前處理提取方法，確定的最優(yōu)萃取條件為：萃取劑為70％甲醇，超聲功率120W，超聲時間25min，料液比1∶30；6種Amadori化合物的測定線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0．995 0；方法的檢出限（LOD）為20．06～39．86μg／kg，定量限（LOQ）為66．85～132．9μg／kg，平均回收率在86．56％～88．86％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5％。該方法的前處理簡單、定量限低，回收率和精密度均能滿足煙草中Amadori化合物的分析要求，可為我國煙草行業(yè)香味前體物質(zhì)的研究提供技術(shù)支持。

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Simultaneous Determination of Six Kinds of Amadori Compounds in Tobaccos by LC－MS／MS

JIA Chun－xiao1，XIU Long－fei2，MOU Ding－rong3，MAO Duo－bin2
（1．College of Material and Chemical Engineering of Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou450002，China；2．College of Food and Bioengineering of Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou450002，China；3．Research and Development Center of Hongta Tobacco（Group）Corporation．，Ltd，Yuxi 653100，China）

A liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）method for qualitatively and quantitatively analyzing six kinds of Amadori compounds（Fru－Gly，F(xiàn)ru－Ala，F(xiàn)ru－Pro，F(xiàn)ru－Thr，F(xiàn)ru－Glu and Fru－Amb）in tobaccos was developed．The sample was extracted with 70％methanol water solutionsand assisted by ultrasound，and the extraction conditions which were optimized by orthogonal experiment as followings：the solid liquid ratio was 1∶30，the extraction power was 120W，and the extrac－

tobacco；liquid chromatography－tandem mass spectrometry（LC－MS／MS）；Amadori compounds

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0045－07

10．7538／zpxb．youxian．2014．0052

2014－03－10；

2014－04－24

國家自然科學(xué)基金（21176229／B060804）；中國煙草總公司卷煙增香保潤重大科技專項（110201101025（BR－07）資助

賈春曉（1965—），女（漢族），河南南陽人，教授，從事天然產(chǎn)物和煙草化學(xué)方面研究。E－mail：jiachx＠zzuli．edu．cn

毛多斌（1962—），男（漢族），河南南陽人，教授，從事煙草化學(xué)和有機合成方面研究。E－mail：maoduobin＠zzuli．edu．cn

時間：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0052．html

tion time was 25min．The extraction products from tobaccos were cleaned up by hexane and then analyzed by LC－MS／MS under the selected reaction monitoring（SRM）mode．The contents of six kinds of Amadori compounds were determined by external standard curve method．The results show that the limits of detection（LOD）are 20．06－39．86μg／kg，and limits of quantity（LOQ）are 66．85－132．9μg／kg．The correlation coefficients are greater than 0．995 0，the average recoveries are 86．56％－88．86％，and the relative standard deviations（RSD）are less than 5％．This method is simplify，sensitive and accurate，which is suitable for qualitative and quantitative analysis of Amadori compounds in tobaccos．