29個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

王新杰，羅莉靜，黃磊，許欣

（1.濰坊市公安局，山東濰坊 261061；2.山東省公安廳，山東濟(jì)南 250001）

29個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

王新杰1，羅莉靜1，黃磊2，許欣1

（1.濰坊市公安局，山東濰坊 261061；2.山東省公安廳，山東濟(jì)南 250001）

目的建立29個(gè)Y-STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系，進(jìn)行遺傳多態(tài)性調(diào)查，并評(píng)價(jià)其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。方法采用五色熒光標(biāo)記技術(shù)，對(duì)29個(gè)Y-STR基因座（DYS456、DYS389Ⅰ、DYS437、DYS447、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS522、DYS460、DYS458、DYS622、DYS390、DYS392、DYS448、DYS449、DYS391、Y-GATA-H4、DYS388、DYS19、DYS385a/b、DYS527a/b、DYS393、DYS459a/b、DYS635、DYS439、DYS570和DYS627）進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)。調(diào)查山東漢族2000名無(wú)關(guān)男性個(gè)體29個(gè)Y-STR基因座的遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)，并對(duì)系統(tǒng)性能進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果本方法同時(shí)檢測(cè)29個(gè)Y-STR基因座，在2000名個(gè)體中共檢出1981種單倍型，基因多樣性在0.3700～0.9654。方法特異性好，分型結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，靈敏度達(dá)0.05ng，實(shí)際案例常見生物檢材的檢驗(yàn)結(jié)果良好。結(jié)論29個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)法可以用于實(shí)際案例檢驗(yàn)，調(diào)查所獲數(shù)據(jù)對(duì)建立Y-STR數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)研究和應(yīng)用具有重要意義。

法醫(yī)遺傳學(xué)；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；Y染色體；短串聯(lián)重復(fù)序列

Y染色體STR單倍型父系遺傳的特點(diǎn)在諸如父系家族的親權(quán)鑒定、混有女性或多人份男性混合斑中男性個(gè)體分型以及追溯父系遷移歷史等方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值[1]。由于Y-STR基因座呈單倍型遺傳，其識(shí)別能力通常低于同等數(shù)目常染色體STR基因座，不能用于個(gè)體同一認(rèn)定，且Y-STR基因座的多態(tài)性在不同人群的差異也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常染色體基因座。因此，為獲得較高的系統(tǒng)鑒別能力，應(yīng)盡量選擇多態(tài)性高的基因座，并盡可能在系統(tǒng)中納入更多的STR基因座。本研究采用五色熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)對(duì)29個(gè)Y-STR基因座進(jìn)行檢測(cè)，并調(diào)查山東地區(qū)漢族人群的遺傳多態(tài)性，以評(píng)價(jià)其在法醫(yī)學(xué)常見物證檢材中應(yīng)用的價(jià)值，旨在為法庭科學(xué)DNA分析提供一種新方法，并為相關(guān)分析和研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

遺傳多態(tài)性調(diào)查樣本2 000份男性無(wú)關(guān)個(gè)體血樣為實(shí)驗(yàn)室日常積累。種屬特異性測(cè)試樣本：黑猩猩、獼猴、狒狒血樣取自濰坊市動(dòng)物園，豬、牛、驢、狗、貓、魚購(gòu)于市場(chǎng)。男性特異性測(cè)試樣本：男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品

007和女性DNA標(biāo)準(zhǔn)品9947A，按照1∶1 000的比例混合；20份女性無(wú)關(guān)個(gè)體血樣來(lái)源于日常積累。實(shí)際案件樣本：本實(shí)驗(yàn)室日常積累的案件檢材，包括血斑、精液（陰道液）混合斑、汗液斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉組織、骨骼及毛發(fā)。

1.2 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

1.2.1 基因座選擇及引物設(shè)計(jì)

考慮到不同試劑盒的兼容性，本研究首先選擇AmpF詛STR誖Yfiler誖PCR擴(kuò)增試劑盒（簡(jiǎn)稱Yfiler試劑盒）、PowerPlex誖Y23試劑盒和AGCU 24Y熒光檢測(cè)試劑盒（美國(guó)AB公司）共同包含的17個(gè)Y-STR基因座，在此基礎(chǔ)上又增加了12個(gè)Y-STR基因座，以獲得更高的系統(tǒng)鑒定能力。29個(gè)Y-STR基因座堿基序列查自基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]。

設(shè)定所選目標(biāo)基因座的片段大小范圍后，在目標(biāo)重復(fù)序列兩側(cè)，用Primer Express誖Software Version 3.0設(shè)計(jì)引物，對(duì)獲得的單基因座引物的擴(kuò)增條件先進(jìn)行優(yōu)化，必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物，直至得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

在成功建立單基因座擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定復(fù)合擴(kuò)增中的各個(gè)參數(shù)，使各基因座擴(kuò)增產(chǎn)物基本達(dá)到平衡、特異的要求，最終建立多重復(fù)合擴(kuò)增體系。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和標(biāo)記，29個(gè)基因座的相關(guān)信息見表1。

表1 29個(gè)基因座的相關(guān)信息

1.2.2 PCR擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)總體積為10 μL，內(nèi)含DNA模板0.5～ 2ng，dNTP 250 μmol/L，MgCl22.0 mmol/L，1×緩沖液，金牌Taq酶2U，純水補(bǔ)至10μL，引物及濃度（μmol/L）分別為DYS456（0.38）、DYS389Ⅰ/Ⅱ（0.54）、DYS437（0.24）、DYS447（1.11）、DYS438（0.91）、DYS522（1.21）、DYS460（0.25）、DYS458（0.38）、DYS622（0.25）、DYS390（0.35）、DYS392（7.35）、DYS448（0.30）、DYS449（0.83）、DYS391（0.30）、Y-GATA-H4（0.89）、DYS388（2.21）、DYS19（5.43）、DYS385a/b（1.56）、DYS527a/b（0.66）、DYS393（0.96）、DYS459a/b（1.71）、DYS635（1.21）、DYS439（1.01）、DYS570（1.91）和DYS627（8.05）。熱循環(huán)參數(shù)：95℃11 min；94℃1 min，59℃1 min，72℃1min，28個(gè)循環(huán)；60℃60min，4℃保溫。

1.2.3 電泳及Y-STR分型

取PCR產(chǎn)物1μL與9μL去離子甲酰胺、0.2μL

LIZ-500混勻，95℃3 min后立即冰浴3 min。使用3130XL型遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）以3kV 10s進(jìn)行電泳分離。GeneMapper誖ID v3.2軟件進(jìn)行分析判型。

1.3 擴(kuò)增體系技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證

一致性驗(yàn)證：2 000份無(wú)關(guān)男性血樣按本研究方法進(jìn)行擴(kuò)增及分型檢測(cè)，其Y-STR分型結(jié)果與Yfiler試劑盒分型結(jié)果進(jìn)行比較。

靈敏度驗(yàn)證：取男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品007稀釋至2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.05、0.025ng/μL，按本方法平行重復(fù)檢測(cè)3次。

種屬特異性驗(yàn)證：取人源性和非人源性DNA（黑猩猩、獼猴、狒狒、豬、牛、驢、狗、貓、魚）按本方法檢測(cè)Y-STR基因座。

男性特異性驗(yàn)證：取20份女性DNA樣本；0.1ng標(biāo)準(zhǔn)品007和100 ng標(biāo)準(zhǔn)品9947A以1∶1 000比例混合后；分別按本方法檢測(cè)分析。

案件檢材適應(yīng)性驗(yàn)證：取案件檢材血斑、精液（陰道液）混合斑、汗斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉、骨骼及毛根，提取DNA后采用本方法檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算29個(gè)Y-STR基因座等位基因頻率和單倍型頻率?；蚨鄻有裕℅D）或單倍型多樣性（HD）用公式GD（HD）=n（1-∑Pi2）/（n-1）計(jì)算，其中n為樣本數(shù)，Pi為等位基因頻率或單倍型頻率[2]。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)評(píng)價(jià)

采用本研究方法，29個(gè)Y-STR基因座均得到有效擴(kuò)增，采用0.5ng DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，平均峰高約2000RFU，且各基因座間擴(kuò)增產(chǎn)物峰高均衡，峰型對(duì)稱尖銳、無(wú)釘子峰和其他干擾峰，基線平（圖1）。將各個(gè)基因座上含不同等位基因的樣品單個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按比例混合，平衡后再將等位基因混合物稀釋1000～10000倍后再次擴(kuò)增，所得產(chǎn)物作為該基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（圖2）。2000份無(wú)關(guān)男性個(gè)體血樣經(jīng)本研究方法檢測(cè)，結(jié)果與Yfiler試劑盒相同基因座的分型結(jié)果均完全一致，說(shuō)明本研究方法具有較好的準(zhǔn)確性和一致性。

本研究最佳模板量在0.125～1.0ng/μL，模板量低至0.05ng/μL仍可獲得完整STR分型結(jié)果，但峰值可小于80RFU。模板量在1.0～2.0ng/μL時(shí)，仍可獲得較好的分型結(jié)果，且未出現(xiàn)拔起峰等雜峰。

用本研究方法對(duì)黑猩猩、獼猴、狒狒、豬、牛、驢、狗、貓、魚9種動(dòng)物樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果黑猩猩因與人DNA同源性高達(dá)98%[5]，共檢測(cè)出9個(gè)擴(kuò)增片段，但其中4個(gè)峰位于基因座等位基因bin上，4個(gè)位于bin中間，1個(gè)峰位于兩個(gè)基因座之間，與人DNA檢測(cè)結(jié)果有明顯區(qū)別，故不影響對(duì)人樣本的判型，但如果發(fā)現(xiàn)混合分型時(shí)應(yīng)注意鑒別[6]。狒狒、獼猴和非靈長(zhǎng)類動(dòng)物的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品007和女性DNA標(biāo)準(zhǔn)品9947A按1∶1 000的比例混合后用本方法檢測(cè)，結(jié)果男性樣本可準(zhǔn)確分型，未發(fā)現(xiàn)女性樣本干擾。此外，曾有報(bào)道[7]在DYS391和DYS393基因座上有個(gè)別女性樣本出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，而20例女性樣本均未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，對(duì)血斑、精液（陰道液）混合斑、汗液斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉組織、骨骼及毛根等樣本，經(jīng)磁珠法提取DNA后采用本研究方法擴(kuò)增檢測(cè)，均獲得29個(gè)基因座的分型，結(jié)果與Yfiler相同基因座的結(jié)果一致。

圖1 29個(gè)Y-STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增分型圖譜

圖2 等位基因標(biāo)準(zhǔn)物分型圖譜

2.2 29 個(gè)Y-STR基因座遺傳多態(tài)性

2000 名山東漢族男性無(wú)關(guān)個(gè)體29個(gè)Y-STR基因座檢出等位基因數(shù)分別為DYS456（8）、DYS389Ⅰ（7）、DYS437（8）、DYS447（12）、DYS389Ⅱ（12）、DYS438（6）、DYS522（7）、DYS460（6）、DYS458（14）、DYS622（11）、DYS390（9）、DYS392（8）、DYS448（10）、DYS449（19）、DYS391（6）、Y-GATA-H4（7）、DYS388（8）、DYS19（9）、DYS385a/b（18）、DYS527a/b（18）、DYS393（7）、DYS459a/b（5）、DYS635（8）、DYS439（8）、DYS570（10）和DYS627（19），各等位基因頻率及GD值見表2～3，除DYS391、DYS438外，其余基因座的GD值均大于0.5。

表2 29個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率（n=2000）

續(xù)表2

表2 29個(gè)Y-STR基因座的基因多樣性（n=2000）

2000名個(gè)體樣本使用本方法共檢出1981種單倍型，其中19種單倍型出現(xiàn)2次。Y染色體單倍型多樣性與個(gè)體識(shí)別能力、非父排除率數(shù)值相同[3]，而單倍型多樣性值越接近1，家系鑒別能力越強(qiáng)。本方法調(diào)查2000名個(gè)體的單倍型多樣性值為0.999 990 495，說(shuō)明具有很強(qiáng)的家系鑒別能力，對(duì)案件鑒定、Y-STR數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)、遺傳關(guān)系的研究有重要意義。與本研究中單獨(dú)采用Yfiler試劑盒相比較，Yfiler試劑盒檢出1950種單倍型，其中50種單倍型出現(xiàn)2次，單倍型多樣性值為0.999974987，本方法的家系鑒別能力明顯增強(qiáng)。

綜上，本研究建立的29個(gè)Y-STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系與其他方法相比具有較大的兼容性、更高的單倍型多樣性，在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用、遺傳學(xué)研究中有較大的應(yīng)用潛力。

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Establishing a 29 Y-STR Loci Multiplex PCR System

WANG Xin-jie1,LUO Li-jing1,HUANG Lei2,XU Xin1
（1.Weifang Public Security Bureau,Weifang 261061,China;2.Shandong Province Public Security Department,Jinan 250001,China）

Objective To establish a 29 Y-STR loci multiplex PCR system for investigating the genetic polymorphisms and to assess its application value in forensic science.Methods A multiplex PCR system was established using a five color fluorescence labeling 29 Y-STR loci（DYS456,DYS389Ⅰ,DYS437, DYS447,DYS389Ⅱ,DYS438,DYS522,DYS460,DYS458,DYS622,DYS390,DYS392,DYS448,DYS449, DYS391,Y-GATA-H4,DYS388,DYS19,DYS385a/b,DYS527a/b,DYS393,DYS459a/b,DYS635,DYS439, DYS570 and DYS627）for multiple amplification and capillary electrophoresis.And its applicability was validated with genetic polymorphism data of 29 Y-STR of unrelated 2 000 male samples in Shandong Han population.Results A total of 1 981 different haplotypes of 2000 individuals showed genotype diversity between 0.3700 and 0.9654.The system provided stable and accurate typing with high sensitivity of 0.05 ng.It satisfied the needs of variety of routine biological samples.Conclusion The 29 Y-STR loci multiplex PCR system could be applied for actual cases and establishment of Y-STR database.In addition,it has great significance in forensic science practices and related research.

forensic genetics;polymorphism,genetic;Y Chromosome;short tandem repeat sequences

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.011

1004-5619（2015）06-0456-06

2014-09-24）

（本文編輯：李成濤）（

2015-08-25）

王新杰（1973—），男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)檢驗(yàn)；E-mail：wfxjfy@aliyun.com