大鼠甲醇中毒后體內(nèi)的甲酸分布

劉冬梅，周姝，陳捷敏，夏文濤

（1.上海華醫(yī)司法鑒定所，上海 200335；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海 200063）

大鼠甲醇中毒后體內(nèi)的甲酸分布

劉冬梅1，2，周姝2，陳捷敏2，夏文濤2

（1.上海華醫(yī)司法鑒定所，上海 200335；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海 200063）

目的研究大鼠甲醇中毒后血液及體內(nèi)主要組織中甲酸的濃度及分布特點。方法將SD大鼠分為對照組、中毒3d組和中毒7d組，中毒模型按照首劑量8mL/kg給予大鼠甲醇灌胃，24h后給予減半劑量4mL/kg再次灌胃，在首次灌胃后的3d和7d將大鼠引頸處死，采心血并提取肝、腎、腦、心和胃組織，利用高效液相色譜儀檢測其中的甲酸含量。結(jié)果甲酸在組織中的濃度高于血液中；與中毒3d組比較，中毒7d組腦和胃組織內(nèi)的甲酸質(zhì)量濃度有一定的增加趨勢，而肝和腎組織中的甲酸質(zhì)量濃度有所下降（P<0.05）。結(jié)論高效液相色譜法可以作為一種準(zhǔn)確檢測甲酸的定性定量方法。大鼠甲醇中毒后，其代謝產(chǎn)物甲酸在血液及組織中均有蓄積，在器官組織中的蓄積更顯著。

法醫(yī)毒理學(xué)；中毒；甲醇；甲酸；高效液相色譜法；組織分布

甲醇中毒事件常呈現(xiàn)群體性爆發(fā)，時間與地區(qū)分布也相對集中，可能引起嚴(yán)重的民事糾紛甚至刑事訴訟。鑒于其損害后果的嚴(yán)重性及社會影響的惡劣性，甲醇中毒的毒性機制受到了法醫(yī)工作者的密切關(guān)注。

急性甲醇中毒后，甲醇在體內(nèi)經(jīng)過醇脫氫酶的催化作用被氧化為甲醛，甲醛在醛脫氫酶的催化作用下被氧化為甲酸[1]。研究[2]表明，甲醛和甲酸的毒性損害作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甲醇本身。雖然甲醛具有較大的毒性作用，但因其在體內(nèi)停留時間極短暫，所以在甲醇中毒中，甲酸較甲醛發(fā)揮了更顯著的毒性作用。目前對甲酸含量檢測方法的研究仍不夠成熟，且國內(nèi)僅見關(guān)于血液和尿液中甲酸含量的報道[3-4]。國外有學(xué)者應(yīng)用頂空氣相色譜法分析尸體血液中的甲醇和甲酸，但該方法并未經(jīng)過驗證[5]。Morris[6]采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）在210 nm

吸收波長下檢測到了蛋清溶液中的甲酸。本研究采用HPLC，優(yōu)化了前處理過程，檢測大鼠甲醇中毒后血液中甲酸含量，并對其分布特點進行研究，為甲醇中毒機制研究及法醫(yī)毒理學(xué)鑒定提供一定的線索及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 甲醇中毒模型及分組

選擇體質(zhì)量200～250 g的健康雄性SD大鼠（由上海斯萊克實驗動物有限公司提供）30只，分為對照組、中毒3d組和中毒7d組，每組10只大鼠。將實驗動物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)溫度和濕度的環(huán)境下，12h明暗交替的光照，不限食物與水的供給。將一氧化二氮與氧氣的混合氣體［V（N2O）/V（O2）=1∶1，由上海申通氣體有限公司供給］按2 L/min的速度通入裝有實驗動物的密閉容器中，持續(xù)24h，使大鼠去葉酸化[7]。按照首劑量8mL/kg（介于中毒量和半數(shù)致死量）[8]給予大鼠甲醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純級）灌胃，對照組給予等量的生理鹽水。24 h后給予減半劑量4mL/kg再次灌胃。甲醇首次灌胃后的3d和7d斷頸處死，對照組在生理鹽水灌胃后1 d處死，采心血置于經(jīng)EDTA處理的抗凝管中，并提取肝、腎、腦、心和胃組織，置于-80℃冰箱保存。

1.2 儀器與分析方法

采用Thermo U3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司），色譜柱為Calesil ODS-100 C18柱（4.6mm×250mm，5μm），二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司），溫度設(shè)置為室溫，流動相為甲醇與超純水的混合物［V（甲醇）/V（超純水）=6∶4］，流速控制在1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長設(shè)置為215 nm。Thermo Scientific Sorvall ST 40離心機（美國Thermo Fisher公司）。

配置一系列已知濃度的甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純級）溶液，質(zhì)量濃度分別為0.305、0.610、1.220、2.440mg/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品前處理

在檢測甲酸含量前，采用FastPrep-24樣品處理系統(tǒng)（美國MP Biomedicals公司）處理組織，振蕩速度設(shè)置為4.5m/s，時間為2～3min。將血液和研磨后的組織漿液樣本以離心半徑10cm，10000r/min，離心10min，按V（上清液）∶V（流動相）=6∶4混合均勻待進樣。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)曲線

將甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)色譜峰的保留時間出現(xiàn)在1.98～2.07min（圖1）。根據(jù)色譜峰面積（y）與甲酸質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=15.837x-6.647（R2=0.992）。

圖1 甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.2 血液及組織中的甲酸含量

血液中甲酸的檢測結(jié)果見圖2，發(fā)現(xiàn)在2.02 min出現(xiàn)未知峰，通過與甲酸標(biāo)準(zhǔn)品進行比對，確定該未知峰為甲酸色譜峰。同樣，在肝、腎、腦等組織中，在該時間點內(nèi)亦檢測到甲酸色譜峰。基于甲酸質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到血液及肝、腎等組織中的甲酸含量，見表1。結(jié)果顯示，甲酸在組織中的含量高于血液（P< 0.05）。與中毒3d組比較，中毒7d組的腦和胃組織內(nèi)甲酸含量有一定的增加，而肝和腎組織中甲酸含量反而有所下降（P<0.05）。

圖2 各組血液中甲酸的色譜圖

表1 血液及組織中甲酸含量［n=10，mg/mL（mg/g）］

表1 血液及組織中甲酸含量［n=10，mg/mL（mg/g）］

注：1）與相同中毒時間血液中質(zhì)量濃度相比，P<0.05；2）與中毒3d組相同組織中含量相比，P<0.05

組別血液肝腎腦心胃對照<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05中毒3d0.61±0.078.01±0.631）8.42±1.241）6.20±0.261）8.06±0.401）9.02±3.531）中毒7d0.60±0.056.58±0.821）2）6.80±2.061）2）7.69±2.521）2）7.94±0.961）10.09±5.311）2）

3 討論

甲醇中毒對視網(wǎng)膜、視神經(jīng)及神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯的選擇性毒性作用。據(jù)報道[9]，急性甲醇中毒后95.2%的患者出現(xiàn)不同程度的視力下降和眼底改變，76.2%表現(xiàn)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的癥狀和體征。甲酸，俗名“蟻酸”，是無色而有刺激性氣味的液體，易混溶于醇類等有機溶劑。作為甲醇的中間代謝產(chǎn)物，研究認(rèn)為甲酸可通過抑制細(xì)胞色素氧化酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成的減少，從而引起乳酸酸中毒，酸中毒進一步加劇了超氧化物陰離子和自由基的產(chǎn)生，又反過來破壞線粒體和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[10]。另外，甲酸可引起組織缺氧，尤其是在腦、腎和心等需氧量大的器官[11]，其被認(rèn)為是甲醇毒性作用中的關(guān)鍵成分[1]。國外學(xué)者Garner等[12]發(fā)現(xiàn)，大鼠甲醇中毒后，視網(wǎng)膜電圖OPs波的潛伏期出現(xiàn)非選擇性的延遲，振幅呈現(xiàn)不同程度的下降，且隨著甲酸含量的升高，其振幅下降更明顯。但也有學(xué)者[13]認(rèn)為，甲醇中毒的眼部毒性作用源于甲醇的代謝產(chǎn)物——甲醛對視網(wǎng)膜的損害，而非甲醇和甲酸的毒性作用。Matsumoto等[14]對甲醇染毒后甲醛在兔體內(nèi)的代謝進行研究發(fā)現(xiàn)，甲醛并沒有在血液中蓄積或者與體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，而是被快速代謝為甲酸。在大鼠甲醇中毒以后，血液和尿液中甲酸含量分別是甲醛的30倍和29倍，且房水中甲酸含量最高，血液次之[15]。據(jù)此，甲酸在體內(nèi)停留的時間比甲醛長，發(fā)揮的毒性作用也應(yīng)比較顯著，并且甲醇中毒的毒性作用大小與甲酸在體內(nèi)的分布存在著一定的關(guān)聯(lián)性。

高效液相色譜（HPLC），又稱高壓液相色譜，是色譜法的一個重要分支。其以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對樣品的分析。目前，HPLC已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、食品等領(lǐng)域中重要的分離、分析技術(shù)。Seme等[16]利用HPLC測定了大鼠甲醇中毒后72h內(nèi)不同時間點血液中的甲酸含量，發(fā)現(xiàn)血液中甲酸含量呈線性增加，提示甲酸在大鼠體內(nèi)代謝非常緩慢。

急性甲醇中毒往往在2～3 d后出現(xiàn)較明顯的臨床癥狀、體征，7d后隨著甲醇的代謝，一部分癥狀及體征可能恢復(fù)，但神經(jīng)系統(tǒng)、眼球等敏感器官可能會遺留一定程度的功能障礙。在前期研究[17]發(fā)現(xiàn)，甲醇中毒后3d和7d是研究大鼠中毒癥狀的有效時間，故本研究繼續(xù)采用這兩個時間點觀察，并成功建立了典型的大鼠甲醇中毒模型。本研究中，將甲醇中毒后兩個時間點不同組織內(nèi)的甲酸含量進行比較后發(fā)現(xiàn)，甲酸在中毒3d和7d的大鼠血液及其他組織中代謝都較緩慢，濃度并未隨時間的延長出現(xiàn)顯著的下降，提示甲酸在甲醇中毒后存在一定的蓄積。相比較而言，組織中的甲酸含量明顯高于血液中，考慮因血液屬于機體的循環(huán)系統(tǒng)，可及時將包括甲酸在內(nèi)的各類物質(zhì)輸送到相應(yīng)的靶器官，故導(dǎo)致甲酸在各組織中的含量較血液中高，并繼發(fā)各組織的結(jié)構(gòu)破壞和功能損害。前期研究[17]對肝、腎的組織病理學(xué)檢驗也證實，甲醇中毒以后肝和腎的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表現(xiàn)為腎小球嚴(yán)重充血，肝小葉和肝竇擴張、充血，中央靜脈充血等。甲醇中毒早期腦組織內(nèi)的甲酸含量較其他組織略低，而在中毒7 d后，肝、腎等作為主要代謝器官，其中的甲酸含量存在一定的下降趨勢，而腦組織內(nèi)的甲酸含量卻有升高趨勢，所以，甲酸在神經(jīng)組織中的蓄積作用可能更明顯，甲酸對神經(jīng)組織的損害作用也可能更為明顯。因視網(wǎng)膜量少且提取困難，本研究未檢測視網(wǎng)膜中的甲酸含量，但考慮視網(wǎng)膜及視神經(jīng)同樣為神經(jīng)組織，故其中的甲酸分布可能與腦組織中的甲酸分布接近。在后續(xù)研究中，本研究小組擬改進視網(wǎng)膜組織的提取方法，擴大樣本量，以研究甲醇中毒后甲醇及甲酸在視網(wǎng)膜及鄰近組織中的分布情況。

在甲酸檢測的前處理方法方面，與血液不同，肝、腎等致密組織中的甲酸分散在組織內(nèi)部，普通的物理學(xué)方法很難將其完全釋放出來，而FastPrep-24樣品處理系統(tǒng)可以高效、快速、穩(wěn)定地破碎各種類型樣本制成組織勻漿，避免了研磨、勻漿、超聲波處理等傳統(tǒng)方法費力、耗時、高損耗及低效等諸多缺點。FastPrep-24系統(tǒng)的樣品裂解在40 s內(nèi)完成，對核酸和蛋白質(zhì)幾乎無破壞作用，并且因不產(chǎn)生熱量，也不會使甲酸揮發(fā)而丟失。本研究采用該處理系統(tǒng)，將肝、腎等組織中的甲酸釋放出來，是本研究的亮點之一。

深入研究甲酸在甲醇中毒機制中的作用，建立一

種能夠穩(wěn)定檢測甲酸的分析方法十分關(guān)鍵。本研究結(jié)果證實，HPLC能夠用于穩(wěn)定地檢測甲醇中毒后血液及組織中的甲酸含量，有望在以后的相關(guān)研究中推廣使用。

FastPrep-24樣品處理系統(tǒng)聯(lián)合HPLC可以作為一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確檢測組織中甲酸的定性定量方法。大鼠甲醇中毒后，其代謝產(chǎn)物甲酸在血液及組織中均具有一定的蓄積作用，且相較血液在器官組織中的蓄積更顯著，并且對神經(jīng)組織的后期損害作用可能更為明顯。

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Distribution of Formic Acid after Methanol Intoxication in Rats

LIU Dong-mei1,2,ZHOU Shu2,CHEN Jie-min2,XIA Wen-tao2
（1.Institute of Huayi Forensic Science,Shanghai 200335,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China）

Objective To investigate concentration and distribution in blood and tissues of formic acid after methanol intoxication in rats.Methods The Sprague-Dawley rats were divided into groups for control group and 3-day and 7-day intoxication treatment groups.The experimental groups were administered methanol by gavage with the initial dose of 8mL/kg and followed with 4mL/kg supplemental dose 24 h later.After 3 days and 7 days later,rats were killed by decapitation.Then samples of cardiac blood,liver,kidney,brain,heart and stomach of each group were collected.Formic acid concentrations were detected by high performance liquid chromatography.Results Formic acid concentrations in tissues were higher than in blood.Compared with 3-day intoxication group,there was an increase formic acid of concentration in brain and stomach in 7-day intoxication group,while a decrease in liver and kidney（P<0.05）.Conclusion High performance liquid chromatography could be used to accurately detect formic acid.As the metabolite of methanol,formic acid accumulates in rat blood and tissues after intoxication and the concentrations in organs and tissues are obviously higher than in blood.

forensic toxicology;poisoning;methanol;formic acid;high performance liquid chromatography;tissue distribution

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.009

1004-5619（2015）06-0450-04

2015-03-17）

（本文編輯：高東）（

2015-09-28）

上海市自然科學(xué)基金資助項目（14ZR1442400）；中央級公益基金資助項目（GY2013Z-1）

劉冬梅（1987—），女，碩士，主要從事法醫(yī)臨床學(xué)研究；E-mail：l_dm1987@163.com

陳捷敏，女，副主任法醫(yī)師，助理研究員，主要從事法醫(yī)臨床學(xué)與法醫(yī)毒理學(xué)研究；E-mail：chenjm@ssfjd.cn

通信作者：夏文濤，男，研究員，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)臨床學(xué)的鑒定與研究；E-mail：xiawentao629@ 163.com