一株產(chǎn)漆酶真菌的篩選、鑒定及發(fā)酵研究

陳守菊，李 松，陳阿娜，湯文晶，劉 宇，湯 斌

（安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000）

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）最早發(fā)現(xiàn)于日本紫膠漆樹Rhusvernicifera的浸出液中，是一種含銅的多酚氧化酶，能夠在氧氣作為電子受體的條件下氧化芳香族化合物，且可催化的底物非常廣泛.隨后，幾乎在所有已研究的木腐真菌中均有發(fā)現(xiàn)，同時也存在于部分植物、細菌和昆蟲之中[1].隨著漆酶的發(fā)現(xiàn)和深入研究，在某些小分子化合物作為介體存在的條件下，漆酶還能夠氧化非酚型木質素結構.漆酶對木質素以及與木質素結構相似的許多環(huán)境污染物的降解作用越來越受到人們的重視[2].在紙漿去木質化[3]、有機染料脫色[4]、紡織污水處理[5]、生物傳感器[6]、食品飲料行業(yè)[7]、有機合成[8-10]、藥物合成[11]、醫(yī)療診斷和作為抗癌藥物制備的催化劑[12]、生物防治[13]、生物能源[14-15]等方面，表現(xiàn)出了重要的研究價值和應用潛力，因而日益受到重視.

已報道文獻指出，高等真菌尤其是擔子菌中的白腐真菌[16]（White-rot fungi）是目前最有效的漆酶產(chǎn)生菌種之一.但是從漆酶生產(chǎn)工業(yè)化應用的角度出發(fā)，目前研究的漆酶產(chǎn)生菌株仍具有發(fā)酵產(chǎn)酶時間長或發(fā)酵活力較低等缺點，仍不適用于漆酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，在一定程度上限制了漆酶的廣泛應用.因此，為了更好地滿足生產(chǎn)需求，篩選具有發(fā)酵時間短及發(fā)酵活力高等特點的漆酶產(chǎn)生菌株依然是一個長遠而艱巨的研究任務.本文采用愈創(chuàng)木酚顯色法[17]對多個自然樣本進行篩選，獲得一株發(fā)酵時間較短的漆酶產(chǎn)生菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

（1）篩選樣本.分離樣本采集于安徽省蕪湖市神山公園、赭山公園和清水苗圃園等富含腐爛植物莖葉組織的土壤.

（2）培養(yǎng)基.PDA 培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖20，土豆（浸出汁）200，瓊脂粉15，p H 值自然.篩選培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基添加愈創(chuàng)木酚（0.04%）及卡那霉素（50 mg／L）.種子培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉3，p H值自然.基本發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖20，酒石酸銨8，KH2PO42，MgSO4·7 H2O 0.6，CaCl2·2 H2O 0.8，CuSO4·5H2O 0.25，Tween80 0.25，p H 6.0.

（3）主要試劑與儀器.工具酶、PCR產(chǎn)物回收、純化等DNA操作試劑盒、抗生素和愈創(chuàng)木酚等購自生工生物工程（上海）股份有限公司和寶生物工程（大連）有限公司.其他化學試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品.麩皮、豆粕、玉米粉和豆渣等生物原材料為市購.

Allg64R高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；S1000 Bio-Rad PCR儀（美國伯樂Bio-rad）；S-4800高分辨率場發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）；FD8-3真空冷凍干燥機（美國SIM公司）；雷磁PHS-3E p H計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；GHZ-123B恒溫培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）.

1.2 方法

（1）產(chǎn)漆酶真菌的篩選.將采集的樣本在無菌環(huán)境中進行打碎并進行梯度稀釋.分別取200μL各樣本梯度稀釋液涂布于篩選平板，30℃條件下恒溫培養(yǎng)3～4 d后挑取具有紅褐色氧化圈的菌落進行分離和純化.在完全相同的培養(yǎng)條件下，挑取在一定時間內(nèi)產(chǎn)生紅褐色氧化圈較大的菌株進行復篩和后續(xù)實驗.

（2）漆酶產(chǎn)生菌株的顯微形態(tài)觀察.將在平板上出現(xiàn)氧化圈較大的漆酶產(chǎn)生菌株在30℃下恒溫培養(yǎng)4 d，形成巨大菌落，取菌絲制片，分別進行光學顯微鏡和掃描電鏡觀察，以研究菌絲及孢子形態(tài)特征.

（3）漆酶產(chǎn)生菌株的分子生物學鑒定.分離菌株染色體DNA的提取、質粒DNA的小量制備及DNA的酶切、連接、轉化等分子操作及SDS-PAGE：參見《分子克隆實驗指南》（第二版）進行.其中，以CTAB抽提法獲得的該菌株染色體DNA為模板，以5.8 S r DNA-ITS區(qū)域通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為擴增引物，使用PCR方法獲得該菌株5.8 S r DNA-ITS片段并測序，序列測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成.通過在線數(shù)據(jù)庫Blast／blastp（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Blast）對測定序列進行比對，并使用 MEGA 5.1軟件通過Neighbor-Joining（NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

（4）發(fā)酵種子液的制備.菌種在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后用無菌水洗下孢子，使用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)并稀釋至1×107個／m L.按1%接種量接入裝液量20%（250 m L三角瓶）種子培養(yǎng)基，于30℃、200 r／min條件下培養(yǎng)24 h后作為種子液備用.

（5）漆酶搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化.改變基本發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源、氮源、初始p H值等條件以研究單因素對菌種產(chǎn)漆酶的影響.確定較優(yōu)的單因素后利用正交設計方法對單因素進行組合優(yōu)化.發(fā)酵條件：發(fā)酵液裝液量為20%（250 m L三角瓶），初始p H為6.0，接種量為10%，溫度和轉速分別為30℃和200 r／min.發(fā)酵至不同時間取樣并于12 000 r／min離心5 min，取上清進行酶活力測定.

（6）酶活力測定.采用 ABTS法測定漆酶酶活[18].取1.5 m L 0.5 m M ABTS底物溶液（溶解于0.1 M，p H 4.0的醋酸／醋酸鈉緩沖液）與1.5 m L適當稀釋的酶液在40℃進行反應，測定反應前3 min內(nèi)420 nm處吸光值的變化.定義1 min內(nèi)氧化1μmol ABTS所需要的酶量為一個漆酶活力單位（U）.

（7）漆酶的反應動力學參數(shù).以ABTS為底物，改變底物添加量（20μL、32μL、50μL、100μL、200μL、500μL），在最適溫度和最適p H的條件下測定漆酶活力，按照Lineweaver-Burk作圖法制作雙倒數(shù)圖.由直線的截距計算Vmax和Km.

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶菌株篩選

在27個自然樣本的篩選平板中共得到2個可產(chǎn)生紅褐色氧化圈且菌落形態(tài)具有明顯差異的菌株，可能均是潛在的漆酶產(chǎn)生菌株.其中，在第10號樣本中得到的菌株生長較快且所產(chǎn)氧化圈較大，將該菌株命名為LS-10.挑取菌株LS-10進行培養(yǎng)并觀察其巨大菌落和顯微形態(tài)，如圖1所示.該菌株在PDA平板上生長較快，菌落開始呈白色、致密、圓形、向四周擴展，后從菌落中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色，菌落周圍有白色菌絲生長帶.菌絲纖細，寬度約1.0～2.0μm，產(chǎn)生分生孢子.孢子簇生，呈不規(guī)則橢圓形，有凹，直徑約4μm.根據(jù)形態(tài)學觀察結果初步將LS-10鑒定為木霉屬微生物.

菌株在篩選培養(yǎng)基中產(chǎn)生紅褐色氧化帶正面照片如圖1a所示；菌株在篩選培養(yǎng)基中產(chǎn)生紅褐色氧化帶背面照片如圖1b所示；菌株在PDA培養(yǎng)基中的巨大菌落如圖1c所示；菌絲光學顯微鏡觀察形態(tài)（400倍）如圖1d所示；菌株分生孢子梗形態(tài)（SEM 3500倍）如圖1e所示；分生孢子形態(tài)（SEM 25000倍）如圖1f所示.

2.2 產(chǎn)漆酶菌株分子生物學鑒定

將LS-10菌株的5.8 S r DNA-ITS序列測定結果與GenBank中已登錄的序列進行Blast比對，選擇同源性較高的菌株序列進行分析，使用MEGA5.1軟件中的Neighbor-Joining程序構建系統(tǒng)進化樹，如圖2所示.由圖2可知，該菌株與棘孢木霉Trichodermaasperellum的相似性較高，結合形態(tài)學鑒定結果，將該菌株鑒定為棘孢木霉，并命名為棘孢木霉LS-10.

2.3 產(chǎn)漆酶條件單因素試驗

（1）發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響.使用基本發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基將篩選獲得的菌株LS-10在30℃、200 r／min的條件下培養(yǎng)，期間取樣并測定漆酶活力，菌株LS-10發(fā)酵產(chǎn)漆酶過程如圖3所示.由圖3可知，該菌株在24～48 h內(nèi)產(chǎn)酶速率較快，并在48 h時達到最大產(chǎn)酶水平，但48 h后發(fā)酵液中漆酶水平會急劇下降，因此初步確定該菌株的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時間為48 h.

（2）不同碳源對產(chǎn)酶的影響.分別以2%的葡萄糖、蔗糖、半乳糖等作為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)，并測定漆酶活力，結果如圖4所示.由圖4可知，該菌株以麩皮汁、蔗糖和半乳糖為碳源時產(chǎn)酶水平較高.從發(fā)酵原料成本方面考慮，本研究選擇麩皮汁作為最佳碳源進行后續(xù)研究.研究發(fā)現(xiàn)該菌株LS-10利用10%的麩皮汁作為單一碳源產(chǎn)生漆酶水平較高，如圖5所示.

（3）不同氮源對產(chǎn)酶的影響.以10%的麩皮汁作為碳源，分別以1%的硫酸銨、酒石酸銨、蛋白胨等作為單一氮源發(fā)酵產(chǎn)漆酶，結果如圖6所示.由圖6可知，該菌株LS-10分別以酒石酸銨、豆粕和蛋白胨為單一氮源時產(chǎn)酶水平較高.

（4）不同初始p H對產(chǎn)酶的影響.使用0.1%磷酸緩沖液將發(fā)酵培養(yǎng)基調至不同p H值進行發(fā)酵，結果如圖7所示.由圖7可知，該菌株在發(fā)酵液初始p H 5.5～6.5之間產(chǎn)漆酶水平較高，在較低p H和較高p H范圍內(nèi)產(chǎn)酶水平會急劇下降，表明該菌株LS-10產(chǎn)漆酶能力對p H值較為敏感.

（5）不同Cu2＋濃度對產(chǎn)酶的影響.Cu2＋濃度對菌株LS-10發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響如圖8所示.由圖8可知，一定濃度的Cu2＋對該菌株LS-10產(chǎn)漆酶具有促進作用.銅離子濃度低于1 m M時，漆酶產(chǎn)生水平隨著Cu2＋的增加而提高，但當Cu2＋濃度高于2 m M時將對該菌株的漆酶產(chǎn)生水平造成強烈的抑制作用.其中，在高濃度Cu2＋（4 m M）條件下，發(fā)酵液中菌絲生長受到抑制，菌體得率明顯下降，可能是由于高濃度的Cu2＋對菌體生長產(chǎn)生毒害作用，從而降低了該菌株的發(fā)酵產(chǎn)漆酶水平.

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源組合優(yōu)化

為綜合考察碳源和氮源對該菌株LS-10產(chǎn)漆酶的影響，研究中進一步選取蔗糖、麩皮汁、酒石酸銨和豆粕等4個因素進行3個水平的正交優(yōu)化試驗.選擇L9（34）正交表進行水平組合處理設計，正交試驗數(shù)據(jù)分析如圖9所示，其中A、B、C和D分別代表蔗糖、麩皮汁、酒石酸銨和豆粕.由圖9可知，在所設定的試驗條件下，碳氮源的最優(yōu)組合是A3B1C2D2，即：蔗糖25 g／L、麩皮汁80 g／L、酒石酸銨10 g／L和豆粕18 g／L時，最高酶活力達到571.32 U／L.其中，碳源濃度的變化對該菌株產(chǎn)漆酶影響較大，可能是該菌種發(fā)酵產(chǎn)酶過程中的關鍵影響因素.

2.5 漆酶的反應動力學參數(shù)

Km是酶的一個重要特征，反應了酶同底物的親和力大小.本實驗以ABTS為底物，在最適溫度和最適p H條件下，測定該酶在不同底物濃度時的酶活，按照Line weaver-Burk作圖，結果如圖10所示.計算出Vmax＝3.68 m M／min和Km＝0.018 m M，動力學分析表明該酶與底物的親和力較大.

3 討論

通過愈創(chuàng)木酚顯色法，從土壤中篩選到一株快速產(chǎn)漆酶的絲狀真菌，結合形態(tài)學和分子生物學方法鑒定，確定所篩菌株為棘孢木霉.逐步利用單因素試驗及正交試驗對該菌株的發(fā)酵進行優(yōu)化，確定該菌株產(chǎn)漆酶最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件.碳源是菌體碳架及能量的來源，不同菌株生長和產(chǎn)酶的最適碳源也大都不同.白腐菌的最佳碳源主要有麩皮、蔗糖、葡萄糖及麥芽糖等，最佳氮源主要有豆粕、酵母粉、蛋白胨、硝酸銨及酒石酸銨等[19].研究發(fā)現(xiàn)該菌株以麩皮汁、蔗糖和半乳糖為碳源時產(chǎn)酶水平較高，以酒石酸銨、豆粕和蛋白胨為單一氮源時產(chǎn)酶水平較高，都與白腐菌的最適碳氮源相似.其中，碳源濃度的變化對該菌株產(chǎn)漆酶影響較大，可能是該菌種發(fā)酵產(chǎn)酶過程中的關鍵影響因素.

培養(yǎng)基初始p H直接影響到菌株生長和產(chǎn)酶活動，有大量研究資料表明，真菌產(chǎn)漆酶的最適p H通常為弱酸性.該菌株產(chǎn)漆酶對初始p H比較敏感，在弱酸性p H（5.5～6.5）條件下較利于漆酶表達，而過高或過低的p H均不利于漆酶的產(chǎn)生.同時研究發(fā)現(xiàn)，不加銅離子時，發(fā)酵液中幾乎檢測不到酶活，低濃度的銅離子（1 m M）對該菌株產(chǎn)酶具有顯著的促進作用，而高濃度的銅離子則有強烈的抑制作用，這表明了銅離子作為漆酶的催化活性中心，在發(fā)酵產(chǎn)漆酶的過程中是不可或缺的.綜上，研究中確定該菌株最佳的產(chǎn)酶條件為（g／L）：蔗糖25，麩皮汁80，酒石酸銨10，豆粕18，1 m M Cu2＋，p H 5.5～6.5時，漆酶最高酶活力達到571.32 U／L，高于之前已經(jīng)報道的棘孢木霉最高漆酶酶活500 U／L.研究結果表明，對棘孢木霉產(chǎn)酶條件進行的優(yōu)化是有效的，且動力學分析表明，該酶與底物的親和力較大，這為漆酶的實際應用提供了有價值的參考信息.

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