降解甲醛的假單胞菌菌株的固定化研究

高 勇，顧 銳，汪令翔，孔 芳，蔡為榮

（安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

固定化微生物技術(shù)是指通過(guò)物理或化學(xué)手段，將游離微生物細(xì)胞固定于限定的空間載體上，使其高密度并保持生物活性，在適宜條件下可以增殖、反復(fù)利用的生物技術(shù).固定化微生物技術(shù)與傳統(tǒng)的生物處理方法相比，具有微生物生物濃度易控制、抗（耐）毒性能力強(qiáng)、微生物菌種流失少、反應(yīng)過(guò)程易調(diào)控及效率高等優(yōu)點(diǎn)[6-8].本研究以采集的印染廠長(zhǎng)期浸泡的活性污泥中篩選到的一株可快速降解甲醛的菌株 W1作為出發(fā)菌株，采用海藻酸鈉法對(duì)菌株W1進(jìn)行固定化包埋處理，研究合適的固定化條件，并以甲醛降解率為試驗(yàn)指標(biāo)設(shè)計(jì)正交優(yōu)化，研究各因素對(duì)固定化菌株降解甲醛的影響，為生物法去除甲醛的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從安徽蕪湖中天印染廠長(zhǎng)期浸泡的活性污泥中篩選得到的降解甲醛的菌株W1，由安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院生技實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 試劑與儀器

乙酰丙酮，海藻酸鈉，甲醛液體，冰醋酸均系上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，試劑均為分析純.

TGL-16G高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV-2100分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；HH-2、HH-6（金壇市杰瑞爾電器有限公司數(shù)顯恒溫水浴鍋）；BS-1EA數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器（上海本波儀器有限公司）；SW-CJ-2FD（蘇州凈化設(shè)備有限公司雙人單面超凈工作臺(tái)）.

1.3 培養(yǎng)基配制

優(yōu)化降解培養(yǎng)基（g／L）：K2HPO43.0，KH2PO44.0，MgSO4·7 H2O 0.2，蛋白胨1.2，微量元素母液0.1 m L，調(diào)p H 8.0～9.0，0.68×105Pa滅菌30 min.

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（g／L）：MgSO4·7H2O 0.2，（NH4）2SO42.4，微量元素母液0.1 m L，調(diào)p H 8.0，0.68×105Pa滅菌30 min.

蛋白胨培養(yǎng)基（g／L）：蛋白胨3.0，NaCl 10.0，調(diào)p H 7.0，0.68×105Pa滅菌30 min.

根據(jù)備忘錄，雙方將在核工業(yè)的制造、工程和技術(shù)服務(wù)領(lǐng)域以及用于下一代商業(yè)反應(yīng)堆的先進(jìn)技術(shù)領(lǐng)域開(kāi)展合作。尤其是，雙方準(zhǔn)備在下一代反應(yīng)堆研發(fā)領(lǐng)域開(kāi)展合作。

乙酰丙酮溶液（g／100 m L）：乙酸銨50 g、6 m L冰醋酸及0.5 m L乙酰丙酮試劑溶于100 m L dd H2O水中，4℃冰箱保存.

微量元素母液（g／L）：H3BO36.0，ZnSO4·7H2O 2.0，CoCl2·6H2O 4.0，Na2MoO4·7H2O 0.6，MnCl2·4H2O 0.6，NiCl2·6H2O 0.4，CuCl2·2H2O 0.2.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

（1）甲醛的檢測(cè)方法.甲醛的檢測(cè)參照GB／T 13197-1991的乙酰丙酮分光光度法[9].將10.8 mg／m L甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至10.8μg／m L取數(shù)支25 m L具塞刻度管，分別加入1～8 m L甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，用dd H2O稀釋至刻度線后，各加入2.5 m L乙酰丙酮溶液，顛倒數(shù)次使其混勻，60℃水浴15 min，取出室溫冷卻1 h后在波長(zhǎng)414 nm處，以dd H2O為參比測(cè)量吸光度，減去空白試驗(yàn)所測(cè)得的吸光度，得到校準(zhǔn)值，以甲醛量（μg）為橫坐標(biāo)，校準(zhǔn)值為縱坐標(biāo)，繪制甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線.

（2）菌種的活化.將菌株W1接種于LB斜面上培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌生理鹽水將斜面上的菌苔沖洗下來(lái)，震蕩至菌體分散均勻，配制菌懸液，將其分裝于優(yōu)化的降解培養(yǎng)基中，并加入適量甲醛溶液，150 r／min和30℃搖床振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌種活化.

（3）固定化顆粒的制備.包埋顆粒：將菌株W1活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，在4℃下以2000×g離心7 min，去上清，菌體用0.9%生理鹽水反復(fù)洗滌2～3次，將菌體用生理鹽水配制成菌懸液，無(wú)菌條件下與4%的海藻酸鈉溶液以1∶1（V／V）混合，攪拌混勻，制成細(xì)菌-海藻酸鈉混合液，滴入4%的CaCl2溶液中形成海藻酸鈉凝膠微球，靜置固化2 h，將成型的凝膠微球取出保存于無(wú)菌生理鹽水中，置于4℃冰箱中過(guò)夜充分固定.空白顆粒對(duì)照是以不加菌體的0.9%的生理鹽水以如上方法配制而成.

（4）菌體固定化后的甲醛降解效果.

①蛋白胨水培養(yǎng)基與生理鹽水對(duì)固定化顆粒降解甲醛的效果比較.以一定菌液濃度制成的包埋顆粒做實(shí)驗(yàn)組，空白組中加入與包埋顆粒等量的空白顆粒，每組設(shè)置3個(gè)平行，將錐形瓶置于30℃，150 r／min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣，參照乙酰丙酮法測(cè)定甲醛質(zhì)量濃度，繪制反應(yīng)過(guò)程中甲醛降解曲線圖.

②無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基與生理鹽水對(duì)固定化顆粒降解甲醛的效果比較.根據(jù)出發(fā)菌株的最適p H生長(zhǎng)條件，調(diào)節(jié)生理鹽水的p H值至8.0.實(shí)驗(yàn)組中加入一定量含菌包埋顆粒，空白組中加入與包埋顆粒等量的空白顆粒.將錐形瓶置于30℃、150 r／min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣，參照乙酰丙酮法測(cè)定甲醛質(zhì)量濃度，繪制反應(yīng)過(guò)程中甲醛降解曲線圖.

（5）固定化菌株在不同溫度下的甲醛降解效果.將優(yōu)化降解培養(yǎng)基培養(yǎng)活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的出發(fā)菌株W1，2000×g離心7 min后去上清，加滅菌生理鹽水洗滌2～3次.隨后制成菌懸液，加入到4%的CaCl2溶液中制成固定化顆粒，加入1 g／L甲醛溶液.將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別置于不同溫度（25℃，30℃，37℃），轉(zhuǎn)速均為150 r／min的搖床中培養(yǎng).隔一定時(shí)間取樣，用乙酰丙酮法測(cè)定甲醛質(zhì)量濃度.

（6）固定化菌株在不同p H下的甲醛降解效果.配制p H分別為7、8、9、10、11的6種不同的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，由1.4（5）中同樣方法進(jìn)行設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)及對(duì)照組，隔一定時(shí)間取樣，乙酰丙酮法測(cè)定甲醛質(zhì)量濃度.

（7）正交試驗(yàn).本試驗(yàn)選用L9（33）正交設(shè)計(jì)表在3個(gè)水平上對(duì)培養(yǎng)基類別、p H值、培養(yǎng)溫度3個(gè)因素進(jìn)行分析，以甲醛降解率為測(cè)定指標(biāo)，考察多因素的綜合影響.其因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示.

表1 固定化后處理甲醛的3因素3水平正交試驗(yàn)

表1 固定化后處理甲醛的3因素3水平正交試驗(yàn)

水平（Levels） 培養(yǎng)基類別A p H值B 溫度C（℃）1無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 8 25 2蛋白胨水培養(yǎng)基 9 30 3生理鹽水 10 37

甲醛降解率的計(jì)算公式：

式中，A 為降解前的甲醛含量（g／L）；B 為降解后的甲醛含量（g／L）.

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甲醛含量為橫坐標(biāo)，校正吸光值為縱坐標(biāo)，繪制出甲醛校正曲線如圖1所示.由圖1可知，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 3，因此接下來(lái)實(shí)驗(yàn)中要測(cè)定樣品中的甲醛含量，只需將樣品稀釋到適當(dāng)濃度，測(cè)定其在414 nm處的吸光值，減去空白試驗(yàn)吸光值，將校正吸光值對(duì)照校準(zhǔn)曲線便可求得樣品中的甲醛濃度.

2.2 菌體固定化后的甲醛降解效果

菌體固定化后的甲醛降解過(guò)程如圖2所示.由圖2可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，加入含菌液的固定化顆粒的培養(yǎng)基中甲醛質(zhì)量濃度呈明顯下降趨勢(shì)，而對(duì)照組中的甲醛質(zhì)量濃度則基本保持不變.由此可見(jiàn)，培養(yǎng)基中甲醛含量的減少是由于固定化細(xì)胞降解的結(jié)果，而固定化顆粒本身對(duì)甲醛并無(wú)吸附作用，實(shí)驗(yàn)組中固定化顆粒有較好的甲醛降解效果，24 h甲醛去除率達(dá)到64.70%.

2.3 蛋白胨水培養(yǎng)基與生理鹽水對(duì)固定化顆粒降解甲醛的效果比較

固定化細(xì)胞在蛋白胨水培養(yǎng)基與在生理鹽水中對(duì)甲醛的降解過(guò)程如圖3所示.由圖3可知，固定化細(xì)胞在前者中的甲醛降解能力明顯高于后者，且前者中固定化細(xì)胞降解甲醛可以持續(xù)至48 h，對(duì)應(yīng)的甲醛去除率可達(dá)66.0%，而后者中的甲醛去除率僅在30.8%左右，且此后基本處于平衡狀態(tài).

2.4 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基與生理鹽水對(duì)固定化顆粒降解甲醛的效果比較

固定化細(xì)胞在p H 8.0的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和生理鹽水中對(duì)甲醛的降解過(guò)程如圖4所示.由圖4可知，在p H 8.0的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，甲醛質(zhì)量濃度的降解量明顯高于在生理鹽水中.結(jié)果顯示48 h內(nèi)，前者培養(yǎng)基中的甲醛去除率76.80%，而后者甲醛去除率為31.0%，并且無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基更符合降解外界條件，且固定化細(xì)胞在此培養(yǎng)基中有較高的甲醛去除率.

2.5 固定化菌株在不同溫度下的甲醛降解效果

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)溫度（25℃，30℃和37℃）對(duì)固定化細(xì)胞振蕩培養(yǎng)，對(duì)甲醛的降解過(guò)程如圖5所示.由圖5可知，在48 h內(nèi)，37℃培養(yǎng)條件下的固定化細(xì)胞的甲醛降解效率最低，僅為48.5%；而30℃條件下的固定化細(xì)胞的甲醛降解效率最高，達(dá)到80.3%；25℃條件下的固定化細(xì)胞的甲醛降解效率介于二者之間，為72.3%.

2.6 固定化菌株在不同p H下的甲醛降解效果

固定化菌株在不同p H下的甲醛降解效果如圖6所示.由圖6可知，p H值不同對(duì)固定化細(xì)胞的甲醛降解效果有較大差異，而空白組中甲醛去除率較小.在24 h內(nèi)，p H值為7、8、9、10、11的磷酸緩沖液中甲醛的去除率分別為29.5%、76.8%、80.3%、71.3%、67.5%.其中p H 為9時(shí)，固定化細(xì)胞的24 h內(nèi)甲醛降解效果最好，達(dá)到80.3%.

2.7 正交試驗(yàn)

固定化后處理甲醛3因素3水平正交試驗(yàn)及方差分析如表2、表3所示.

由表2的正交試驗(yàn)極差分析可知，各因素對(duì)試驗(yàn)影響的主次順序?yàn)椋篈（培養(yǎng)基類別）＞C（溫度）＞B（p H）.最佳工藝條件組合為A1B2C2，即固定化細(xì)胞甲醛降解的最適環(huán)境為：溫度30℃，培養(yǎng)基為MgSO4·7 H2O 0.2 g／L，（NH4）2SO42.4 g／L，微量元素母液0.1 m L，p H 值9.在該條件下，甲醛48 h內(nèi)的降解效率高達(dá)80.3%.

由表3方差分析表的F值可以得出培養(yǎng)基類別、p H值、溫度對(duì)甲醛降解效果影響的顯著性.對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度是：培養(yǎng)基類別＞溫度＞p H，因此，在影響甲醛降解效果的3個(gè)因素中，培養(yǎng)基類別對(duì)甲醛降解效果有顯著影響，溫度、p H無(wú)顯著影響.

表2 固定化后處理甲醛3因素3水平L 9（33）正交試驗(yàn)

表3 方差分析表

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選出的耐受甲醛降解菌株P(guān)seudomonas putida W1進(jìn)行固定化研究發(fā)現(xiàn)，以海藻酸鈉為包埋載體，固定化細(xì)胞Pseudomonas putida W1有良好的甲醛降解效率.溫度及p H可有效提高固定化細(xì)胞對(duì)甲醛降解的效率，但均需在一定的合適范圍內(nèi).固定化細(xì)胞甲醛降解的最佳條件為：溫度30℃，培養(yǎng)基為 MgSO4·7H2O 0.2g／L，（NH4）2SO42.4 g／L，p H 9.在該條件下，甲醛48 h內(nèi)的降解效率高達(dá)80.3%.該固定化細(xì)胞顆?？蓱?yīng)用于降解甲醛的反應(yīng)器中，為生物法降解甲醛奠定基礎(chǔ).

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